bFGF通過(guò)上調(diào)Ras/ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)BMSCs表達(dá)Ⅰ型膠原

買 霞，陳 莉，扎拉嘎胡，陳小義，王英慧

(中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)醫(yī)學(xué)院1.細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室、2.天津市職業(yè)和環(huán)境生物標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300162)

干細(xì)胞增殖與分化與其所處的微環(huán)境密切相關(guān)，除細(xì)胞間相互作用外，離不開(kāi)生長(zhǎng)因子調(diào)控［1－2］。研究表明［3－4］，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一種對(duì)中胚層組織和神經(jīng)外胚層細(xì)胞具有促有絲分裂作用的多肽生長(zhǎng)因子，能夠促進(jìn)多種細(xì)胞增殖，促進(jìn)微血管分化，使局部毛細(xì)血管增加，刺激骨細(xì)胞DNA合成，提高骨細(xì)胞合成膠原和非膠原蛋白的能力。

細(xì)胞因子通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用［5］。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKS)家族是真核細(xì)胞接受生長(zhǎng)因子作用后，引起細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的一類重要的酶蛋白信號(hào)系統(tǒng)，參與細(xì)胞的增殖與分化等多種調(diào)節(jié)過(guò)程［6］。但是 Ras/ERK信號(hào)通路在bFGF促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cell，BMSCs)分化過(guò)程中的作用還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以BMSCs為研究對(duì)象，觀察其在bFGF作用下成骨細(xì)胞分化表型變化，以及Ras/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白p42/44ERK表達(dá)水平的變化，探討bFGF誘導(dǎo)BMSCs細(xì)胞分化的作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料bFGF(Sigma公司)，SD大鼠(SPF級(jí))由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心引進(jìn);H-DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco公司);胎牛血清(Biochrom公司);β-actin、Ⅰ型膠原 、P-ERK抗體(均為Santa Cruz公司);SP檢測(cè)試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中杉公司)。UV-2401PC紫外分光光度計(jì)(島津公司，日本);GEIDOC2000凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)(Bil-Rad公司，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組和步驟

1.2.1 BMSCs的分離與擴(kuò)增 取成年SD大鼠2只，脫頸致死，體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇浸泡消毒，在無(wú)菌條件下暴露股骨，剪去股骨兩端關(guān)節(jié)軟骨后用預(yù)冷無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗骨髓腔數(shù)次，收集沖洗液1 000×g離心8 min，棄上清后加入DMEM培養(yǎng)基(其中含胎牛血清質(zhì)量濃度為100 g·L－1，L-谷氨酰胺2.0 mmol·L－1，慶大霉素8萬(wàn)U·L－1)制成細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。通過(guò)細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)皿的附壁特性篩選骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。細(xì)胞擴(kuò)增至第3代時(shí)，用體積分?jǐn)?shù)為0.0025胰蛋白酶消化后懸浮于培養(yǎng)液中備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組BMSCs誘導(dǎo)分化 將第3代BMSCs調(diào)整細(xì)胞密度為5×108·L－1細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶(免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)標(biāo)本接種于加有蓋玻片經(jīng)APES處理的6孔培養(yǎng)板內(nèi))，細(xì)胞接種24 h后，誘導(dǎo)組分別加入不同濃度bFGF:A組終濃度為10 μg·L－1，B 組終濃度為 5 μg·L－1，C 組終濃度為 20 μg·L－1，D組為對(duì)照組只用常規(guī)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3天換液1次，持續(xù)培養(yǎng)28 d。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 BMSCs在誘導(dǎo)后6 h開(kāi)始在倒置光顯微鏡下對(duì)各組細(xì)胞形態(tài)變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，并作照相記錄。收集d 3細(xì)胞3大瓶，常規(guī)制作透射電鏡標(biāo)本，在透射電鏡下觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)Ⅰ型膠原mRNA表達(dá) 收集BMSCs細(xì)胞，TRIzol法提取 A組和 D組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量和純度(RNA在260 nm和280 nm的A值比值為1.8～2.0)，以10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性(28S和18S RNA條帶比值≥2.0)。取1 μg細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，條件如下:30℃ 10 min，42℃30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。采用 Omiga 2.0 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)Ⅰ型膠原引物序列，內(nèi)參照β-actin。引物序列:Ⅰ型膠原上游引物 5'-GGACTTGGGCAAGACAGTGATC-3'，下游引物5'-GTCACGTTCAGTTGGTCAAAGAT-3'，片段長(zhǎng)度 333 bp;β-actin上游引物5'-TGTTTGAGACCTTCAACACCC-3'，下游引物5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'，片段長(zhǎng)度540 bp。擴(kuò)增條件，94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 1 min;共 35 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完畢后取10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計(jì)下觀察，GEIDOC 2000凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)掃描，以靶基因/β-actin A值的比值作為表示不同樣本間的相對(duì)量，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，取均值作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 在誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)取出細(xì)胞爬片各3張，用新鮮配制的預(yù)冷固定液(甲醇 ∶丙酮=1∶1)4℃ 固定10 min，常規(guī)方法進(jìn)行Ⅰ型膠原和p-ERK免疫細(xì)胞化學(xué)染色，蘇木精復(fù)染后，脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，每組觀察3張細(xì)胞爬片，隨機(jī)選擇10個(gè)不同視野(×200)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.2.6 Western blot檢測(cè)p-ERK蛋白表達(dá) 取實(shí)驗(yàn)BMSCs細(xì)胞PBS洗2次，冰上裂解45 min，12 000×g離心10 min，定量上清液中的蛋白。上樣50 μg進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。0.5 g·L－1脫脂奶粉37℃封閉2 h，一抗(mouse anti-p-ERK)4℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次15 min，HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG(1∶4 000)37℃孵育2 h，TBST洗3次，將PVDF膜置于暗盒中，X線曝光，顯影定影。采用Bandscan 5.0軟件測(cè)定各條帶的A值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以±s表示，SPSS 11.0軟件處理。兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn);多組比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察倒置光顯微鏡觀察采用貼壁篩選法分離的BMSCs，原代培養(yǎng)12 h后細(xì)胞開(kāi)始貼壁，24 h后貼壁細(xì)胞可達(dá)20%。以后貼壁細(xì)胞逐漸增多，d 5可見(jiàn)有50%細(xì)胞貼壁，d 7左右細(xì)胞融合80%。此時(shí)以成纖維樣細(xì)胞為主并有集落形成。培養(yǎng)1周后傳代，傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞體積較大，細(xì)胞形態(tài)趨于一致，為成纖維樣細(xì)胞，呈火焰狀生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)較快，為d 7～10傳一代。透射電鏡觀察，對(duì)照組BMSCs細(xì)胞表現(xiàn)出未分化細(xì)胞的特征:細(xì)胞體積較小，核質(zhì)比例較大，核仁大而明顯，細(xì)胞表面有微絨毛，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)核糖體和線粒體，其他細(xì)胞器較少，經(jīng)bFGF作用d 7后細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和分泌泡明顯增加，為成骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特征(Fig 1)。

Fig 1 Morphology changes of BMSCs by electron microscope(×3 000)

2.2 bFGF上調(diào)Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)RT-PCR檢測(cè)示A組d 3、5、7、14、21Ⅰ型膠原 mRNA 水平較D組水平分別上調(diào)1.67倍、2.09倍、1.99倍、2.21倍和1.03倍(Fig 2)。

Fig 2 The mRNA expression levels of collagenⅠin the BMSCs treated with 10 μg·L －1bFGF at different time points by RT-PCR

2.3 bFGF上調(diào)p-ERK蛋白表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白合成免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果表明，A組bFGF作用從d 3開(kāi)始，細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至d 14達(dá)最高(Tab 1，F(xiàn)ig 3);與此同時(shí)A組抗p-ERK免疫細(xì)胞化學(xué)染色在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較D組為高(Tab 2，F(xiàn)ig 4);Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明BMSCs經(jīng)bFGF作用后，A組p-ERK蛋白表達(dá)水平較D組水平分別上調(diào)1.28倍、1.40倍、2.65倍和1.47倍(Fig 5)。

Tab 1 The effect of different concentration group bFGF on the collagen Ⅰ protein in the BMSCs at different time points(%， ± s，n=10)

Tab 1 The effect of different concentration group bFGF on the collagen Ⅰ protein in the BMSCs at different time points(%， ± s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs group D

Group Time(culture)/d 14 21 A 3 5 7 35.4 ±1.04＊＊ 42.6 ±1.05＊＊ 61.6 ±3.18＊＊ 85.4 ±2.10＊＊ 76.3 ±1.14＊＊B 28.8 ±1.15＊＊ 39.7 ±2.12＊＊ 57.8 ±3.22＊＊ 84.7 ±4.32＊＊ 73.4 ±3.12＊＊C 35.6 ±2.04＊＊ 42.8 ±3.05＊＊ 63.7 ±4.16＊＊ 86.3 ±1.01＊＊ 75.3 ±2.04＊＊D 14.6 ±1.01 20.4 ±1.25 31.5 ±1.14 43.8 ±1.19 42.7 ±1.15

Tab 2 The effect of bFGF(10 μg·L －1)on the p-ERK in the BMSCs at different time points(% ， ± s，n=10)

Tab 2 The effect of bFGF(10 μg·L －1)on the p-ERK in the BMSCs at different time points(% ， ± s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs group D

Group Time(culture)/d 14 21 A 3 5 7 38.2 ±2.14＊＊ 51.8 ±2.15＊＊ 63.7 ±4.16＊＊ 86.3 ±1.01＊＊ 85.3 ±2.04＊＊D .8 ±1.15 24.6 ±1.51 29.4 ±1.35 41.5 ±1.14 45.9 ±1.19 47

Fig 3 The protein levels of collagenⅠin the BMSCs by immunocytochemistry(×100)

Fig 4 The protein levels of p-ERK in the BMSCs by immunocytochemistry(×100)

Fig 5 The protein expression levels of p-ERK in the BMSCs treated with 10 μg·L －1bFGF at different time points by Western blot

3 討論

BMSCs由于其在體外易于分離培養(yǎng)和擴(kuò)增，具有多向分化潛能，是近年來(lái)被認(rèn)為是骨組織工程研究的首選種子細(xì)胞［7－8］。bFGF是調(diào)控 BMSCs定向分化、促進(jìn)骨缺損修復(fù)和骨折愈合的首選生長(zhǎng)因子之一，同時(shí)它還是一種強(qiáng)大的毛細(xì)血管增殖刺激劑，能為BMSCs生長(zhǎng)提供充足的血供和營(yíng)養(yǎng)。本研究結(jié)果表明，BMSCs經(jīng)bFGF作用后在光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞為矮柱狀，細(xì)胞之間有突起相連。透射電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)很豐富，并有較多的分泌泡，這些均為成骨樣細(xì)胞的形態(tài)特征。成骨細(xì)胞在成骨時(shí)可分泌含大量膠原纖維(其化學(xué)成分主要是Ⅰ型膠原蛋白)的類骨質(zhì)。通過(guò)RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)方法證明BMSCs在bFGF的作用下，細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白和mRNA表達(dá)均較對(duì)照組高，提示bFGF可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)BMSCs分化為成骨樣細(xì)胞。

越來(lái)越多的研究表明，包括細(xì)胞因子在內(nèi)的胞外刺激信號(hào)從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)是通過(guò)Ras/ERK信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境刺激作出相應(yīng)的反應(yīng)，以調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等重要生理過(guò)程［9－11］。本研究結(jié)果表明，BMSCs在 bFGF 作用較早時(shí)期(24 h)，用抗ERK抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性顆粒就高于對(duì)照組，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞比率逐漸增加，至d 14達(dá)最高，尤以10 μg·L－1bFGF 作用最強(qiáng)，經(jīng) Western blot檢測(cè)，進(jìn)一步證明BMSCs經(jīng)bFGF作用d 14時(shí)，p-ERK蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組高2.65倍，有趣的是此時(shí)細(xì)胞抗Ⅰ型膠原蛋白抗體陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組高出近1倍，mRNA表達(dá)較對(duì)照組上調(diào)2.21倍，提示bFGF誘發(fā)BMSCsⅠ型膠原基因和蛋白的表達(dá)，通過(guò)ERK信號(hào)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)影響其轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程。

bFGF通過(guò)上調(diào)Ras/ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)BMSCs表達(dá)Ⅰ型膠原具有明顯的時(shí)效關(guān)系。但是，對(duì)其量效關(guān)系進(jìn)行研究時(shí)，卻發(fā)現(xiàn) bFGF 在 5、10、20 μg·L－1的濃度范圍內(nèi)，上調(diào)ERK表達(dá)誘導(dǎo)BMSCs細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白和mRNA表達(dá)無(wú)濃度依賴性差異。本研究?jī)H僅在體外培養(yǎng)條件下初步研究了bFGF對(duì)BMSCs細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。有關(guān)成骨細(xì)胞分化的其他表型，如鈣結(jié)合蛋白和堿性磷酸酶的表達(dá)以及促進(jìn)成骨化作用的細(xì)胞因子表達(dá)及其作用機(jī)制仍需做較多的研究工作。

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