酸性成纖維細胞生長因子對順鉑所致血管內(nèi)皮細胞損害保護作用的實驗研究

張鶴瓊，吳世芬，黃巨恩，李校堃

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)護理學(xué)院，廣西南寧 530021;2.溫州醫(yī)學(xué)院生物與天然藥物研究院，浙江溫州 325027)

無論是機械性損傷或藥物化學(xué)刺激性損傷血管壁，都會造成血管內(nèi)皮細胞損傷，導(dǎo)致各種血栓性疾病的發(fā)生。順鉑(cisplatin，DDP)是一種廣譜、有效的抗癌藥物，盡管其腎毒性是臨床應(yīng)用受限的主要因素，但其血管毒性也不容忽視，王現(xiàn)珍等［1］近期研究表明大鼠在高血壓發(fā)病過程中，體內(nèi)各級動脈內(nèi)皮細胞均發(fā)生損傷，大動脈內(nèi)皮細胞功能損傷出現(xiàn)早且程度高于中、小動脈，因此探索如何保護血管內(nèi)皮細胞，是醫(yī)學(xué)研究的熱點。黃巨恩等［2］通過建立慶大霉素損傷的腎模型探討了酸性成纖維細胞生長因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)的保護作用。受此啟發(fā)，本研究開展DDP的血管內(nèi)皮細胞損傷模型，觀察aFGF的保護作用，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑d 1～3 SD大鼠10只，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。低糖D氏改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)為美國Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品;胰蛋白酶為美國Amerco公司產(chǎn)品;DDP為山東齊魯制藥有限公司產(chǎn)品;aFGF由暨南大學(xué)生物工程研究所提供(批號20050618);兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原(Ⅷ-R Ag)多克隆抗體為中杉金橋公司產(chǎn)品;3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)為美國 Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法和步驟

1.2.1 肺微血管內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng) 動物酒精消毒后斷頭置于無菌盤內(nèi)，分層解剖暴露胸腔，從右心室灌注PBS液至雙肺發(fā)白，取出肺組織，剪取胸膜下肺表面1～2 mm厚組織塊，粗剪漂洗，細剪后加入細胞培養(yǎng)液洗滌離心，沉淀物重懸后接種于預(yù)先鋪有明膠的玻璃培養(yǎng)瓶中翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱固定2 h后正轉(zhuǎn)，加入少量培養(yǎng)液使組織塊濕潤，次日補加培養(yǎng)液至適量。

1.2.2 細胞的傳代培養(yǎng)及種板 原代細胞培養(yǎng)7～9 d后，細胞融合成單層，占滿瓶底的80%以上，PBS液洗滌后加入0.25%胰蛋白酶消化2～5 min，顯微鏡下觀察，細胞連接松解變圓且部分漂離瓶底時終止消化，吸管吹打使細胞脫落，離心后棄去上清，加入培養(yǎng)基重新分瓶用于細胞鑒定或細胞計數(shù)接種于96孔板用于后期實驗。

1.2.3 血管內(nèi)皮細胞的鑒定 使用兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原(Ⅷ-R Ag)多克隆抗體和SP試劑盒，按SP染色法進行，PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.2.4 實驗分組與藥物處理 空白和對照組設(shè)6個復(fù)孔，每個DDP濃度設(shè)4個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。(1)空白組:20%FBS的DMEM培養(yǎng)基。(2)對照組:細胞+20%FBS的DMEM培養(yǎng)基。(3)DDP組:與對照組無異，24 h后加入一系列濃度的DDP，使其終濃度依次為 100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 3 mg·L－1。(4)aFGF+DDP 組:在一系列濃度 DDP的基礎(chǔ)上同時加 aFGF 10 μg·L－1［3］。24 h 后加入二甲基亞砜，酶標儀 492 nm 波長檢測各孔光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法用Bliss法計算各組半數(shù)抑制濃度(50%inhibiting concentration，IC50)，采用 SPSS 13.0 for Windows統(tǒng)計學(xué)軟件統(tǒng)計分析，計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 原代血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)與鑒定種瓶后36 h換液，去除漂浮的組織塊和血細胞，60～72 h可見組織塊周圍內(nèi)皮細胞游出(Fig 1)，剔除組織塊，換液繼續(xù)培養(yǎng)。7d左右可見細胞基本融合成片，呈現(xiàn)明顯的上皮樣細胞形態(tài)，以短梭形或多角形為主，邊界清晰，大小均勻，外觀呈鋪路石樣或鵝卵石樣鑲嵌狀排列生長(Fig 2)。經(jīng)Ⅷ因子多克隆抗體免疫細胞化學(xué)染色，可見染色陽性的細胞質(zhì)出現(xiàn)分布較均勻的棕黃色顆粒，胞核不顯色而呈紫藍色(Fig 3、4)。

Fig 1 After 60 h endothelial cells free out(100×) Fig 2 Primary cultured vascular endothelial cells on d 7(100×) Fig 3 Cells identified by immunocytochemistry ofⅧfactor related antigen(100×) Fig 4 Cells identified by immunocytochemistry ofⅧfactor related antigen(400×)

2.2 DDP對血管內(nèi)皮細胞的毒性及aFGF的拮抗效應(yīng)隨著DDP濃度的增加，細胞生長抑制率升高，加入一定濃度(10 μg·L－1)的 aFGF 后，細胞生長抑制率相應(yīng)減少(Tab 1)。根據(jù)Tab 1中各組不同藥物濃度下相應(yīng)的細胞生長抑制率，用Bliss法通過SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件可計算出各組半數(shù)抑制濃度(IC50)(Tab 2)。結(jié)果顯示:10 μg·L－1濃度的aFGF可減弱DDP對血管內(nèi)皮細胞的損傷，相應(yīng)致使IC50值增高，可見aFGF具有一定的保護作用。

Tab 1 The influence of aFGF at the concentrations of 10 μg·L －1 on growth inhibitory rate of vascular endothelial cells( ± s，n=4)

Tab 1 The influence of aFGF at the concentrations of 10 μg·L －1 on growth inhibitory rate of vascular endothelial cells( ± s，n=4)

DDP/mg·L－1 Inhibitory rate of cell growth after DDP and aFGF were added DDP 10 μg·L －1aFGF+DDP 100 0.9179 ±0.0790 0.9012 ±0.1178 50 0.9109 ±0.1018 0.8904 ±0.0861 25 0.8821 ±0.0330 0.8633 ±0.0873 12.5 0.8260 ±0.0451 0.7983 ±0.0913 6.25 0.6669 ±0.0759 0.6103 ±0.0852 3.125 0.5264 ±0.0830 0.4496 ±0.0952 1.5625 0.3323 ±0.0430 0.2838 ±0.0258 0.7813 0.2058 ±0.0448 0.1674 ±0.0155

Tab 2 The influence of aFGF at the concentration of 10 μg·L －1on the damage of vascular endothelial cells IC50caused by DDP( ± s，n=3)

Tab 2 The influence of aFGF at the concentration of 10 μg·L －1on the damage of vascular endothelial cells IC50caused by DDP( ± s，n=3)

*P＜0.05 vs DDP group

Group 24 h IC50/mg·L －1 DDP 2.5871 ±0.4597 10 μg·L－1aFGF+DDP 3.9763 ±0.1683*

3 討論

建立體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞藥物損傷模型，獲取純化的血管內(nèi)皮細胞是先決條件。本研究通過多種嘗試，發(fā)現(xiàn)肺微血管的組織塊法最簡單、快捷和經(jīng)濟;預(yù)先明膠鋪瓶和倒置干貼壁可增加內(nèi)皮細胞的貼壁率;體積分數(shù)20%胎牛血清則有利于細胞的爬出和較快的生長，而培養(yǎng)基中加入肝素可大大提高了內(nèi)皮細胞的純度。

DDP是一種廣譜、有效的抗癌藥物，通過抗增殖和細胞毒性發(fā)揮著直接抗腫瘤作用。因其強致吐性和嚴重的腎毒性、耳毒性、血管毒性，使其臨床應(yīng)用受到很大限制。近期的研究表明，DDP所致的腎毒性、耳毒性、神經(jīng)毒性與其所致的微血管損害有關(guān)，其機制可能與順鉑在體內(nèi)和體外對內(nèi)皮細胞均有增殖抑制作用有關(guān)［4］。牟坤等［5］研究發(fā)現(xiàn)，低劑量DDP節(jié)律化療體外有抑制血管內(nèi)皮細胞生長、體內(nèi)有抑制血管生成作用。可見，DDP很可能直接作用于內(nèi)皮細胞而發(fā)揮其抑制和損傷作用。

aFGF是一種在體內(nèi)分布廣泛的生長因子，對中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細胞具有促進分裂增殖和損傷修復(fù)的作用。血管內(nèi)皮細胞來源于中胚層，aFGF可與內(nèi)皮細胞表面的FGF受體結(jié)合，發(fā)揮其對細胞損傷的保護作用。黃巨恩等［6］通過動物體內(nèi)、體外實驗表明堿性成纖維細胞生長因子對細胞的酶活性有穩(wěn)定和保護作用，故受電擊后因?qū)?nèi)皮細胞損傷有良好的保護作用而表現(xiàn)出一定的抗凝血作用。劉麗敏等［7］發(fā)現(xiàn)aFGF可促進體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞存活和增殖，并對DDP損傷的腎小管上皮細胞有明顯的保護作用。但aFGF是否對DDP所造成血管內(nèi)皮細胞的損傷具有保護作用，以及機制如何，尚少見文獻報道。本實驗通過體外原代培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞，利用DDP建立損傷模型，借鑒章斌等［3］實驗研究濃度，證明 10 μg·L－1濃度的aFGF可使DDP致傷的血管內(nèi)皮細胞的IC50值升高，表明aFGF對DDP所造成的內(nèi)皮細胞損傷有保護作用，可能與其抵消或削弱DDP的抑制作用而發(fā)揮促增殖和修復(fù)作用直接相關(guān)，至于深入的機制、更具體的濃度范圍和對細胞酶活性以及自由基損傷指標的影響還需在后期的實驗中進一步探討。

［1］ 王現(xiàn)珍，蔣嘉燁，陸家鳳，等.SHR高血壓進程中不同類型血管內(nèi)皮功能損傷及藥物修復(fù)研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26(2):163－8.

［1］ Wang X Z，Jiang J Y，Lu J F，et al.Study in the damage of endothelial function and administration recovery among different arteries during the developing progress of SHR［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(2):163 －8.

［2］ 黃巨恩，王慧杰，劉華鋼，等.酸性成纖維細胞生長因子對慶大霉素誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞損傷的保護作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2007，23(11):1455 －7.

［2］ Huang J E，Wang H J，Liu H G，et al.Protective effects of aFGF on gentamicin-induced injuries of rats renal tubular epithelial cells in vitro［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(11):1455 － 7.

［3］ 章 斌，梅 舉，張寶仁，等.酸性成纖維細胞生長因子促血管內(nèi)皮細胞增殖作用的實驗研究［J］.皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003，22(1):5－7.

［3］ Zhang B，Mei J，Zhang B R，et al.The experimental research on the proliferative action on rat aortic endothelial cells using acidic fibroblast growth factor［J］.Acta Acad Med Wannan，2003，22(1):5 －7.

［4］ Kirchmair R，Walter D H，Ii M，et al.Antiangiogenesis mediates cisplatin-induced peripheral neuropathy:attenuation or reversal by local vascular endothelial growth factor gene therapy without augmenting tumor growth［J］.Circulation，2005，111(20):2662 －70.

［5］ 牟 坤，沈方臻，肖文靜，等.低劑量順鉑節(jié)律化療抗血管生成作用的實驗研究［J］.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，45(2):115－8.

［5］ Mu K，Shen F Z，Xiao W J，et al.Experimental study of effect of low-dose metronomic chemotherapy with cisplatin on anti-angiogenesis［J］.Acta Acad Med Qingdao Univ，2009，45(2):115 － 8.

［6］ 黃巨恩，胡世鳳，鄧桂祥，等.堿性成纖維細胞生長因子對兔血液凝固時間的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2007，23(5):699－700.

［6］ Huang J E，Hu S F，Deng G X，et al.The experimental research of bFGF on the effect of rabbits'blood coagulation time［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(5):699 －700.

［7］ 劉麗敏，劉華鋼，黃巨恩，等.酸性成纖維細胞生長因子對順鉑腎損害保護作用的實驗研究［J］.解剖學(xué)研究，2006，28(4):243－6.

［7］ Liu L M，Liu H G，Huang J E，et al.Protective effects of aFGF on renal tubular epithelial cells damaged by cisplatin in vitro［J］.Anat Res，2006，28(4):243 －6.