扇貝多肽對UVB照射HaCaT細胞后NO釋放及熱休克蛋白70表達的影響

王春波，李金蓮，張正洋，陳雪紅，韓彥弢

(1.青島大學醫學院藥理學教研室，山東青島 266071;2.濱州醫學院機能學實驗室，山東煙臺 264003)

一氧化氮(NO)是細胞在應激狀態下產生的高反應自由基。紫外線照射皮膚生成的NO參與了黑色素的產生、紅斑形成、免疫抑制以及光老化［1］。作為重要的細胞內信使，紫外線照射角質形成細胞后NO何時開始產生，又是如何隨時間而變化，尚未可知。本文采用電子自旋共振(electron spin resonance，ESR)技術，從生物物理角度直接檢測NO的動態釋放過程，并對其產生機制進行分析。同時，探討海洋天然抗氧化劑扇貝多肽(polypeptide from Chlamys farreri，PCF)對紫外線照射后NO動態釋放及HSP70表達的影響，從NO的角度闡述扇貝多肽抗紫外線損傷機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和器材PCF由中國水產科學研究院黃海水產研究所分離純化;DMEM培養基為Gibco產品;iNOS抗體、HSP70抗體購自武漢博士德生物工程有限公司;β-actin抗體購自北京博奧森;iNOS抑制劑SMT購自碧云天生物技術研究所;紫外輻照儀由北京師范大學光電儀器廠制造;ER200DSRC ESR波譜儀為德國Bruker公司產品。

1.2 細胞培養與UVB照射人角質形成細胞HaCaT由韓國延世大學醫學院惠贈。用DMEM完全培養基，置于37℃，含體積分數為5%CO2的培養箱中常規培養。UVB(20 mJ·cm－2)照射時棄去培養基，用PBS漂洗2次，加入2 ml PBS覆蓋細胞。照射結束后棄去PBS，加入培養基進行常規培養。對照組照射時用鋁箔蓋住，其余同處理組。

1.3 電子自旋共振(electron spin resonance，ESR)檢測NO釋放量取5×107細胞，消化后離心，用0.2 mol·L－1的磷酸 HEPES 緩沖液(0.038 mol·L－1NaH2PO4，0.162 mol·L－1Na2HPO4，0.01 mmol·L－1EDTA，10 mmol·L－1HEPES，0.32 mol·L－1蔗糖，5 mmol·L－1巰基乙醇，10 mmol·L－1PBN，體積分數為 0.005的吐溫 80，2 mmol·L－1DETAPAC)冰浴勻漿，4℃、12 000r·min－1離心 10 min;取上清 1.4 ml，分別加入 0.5 mol·L－1Na2S2O4，0.6 mol·L－1DETC，10 mmol·L－1L-Arg，0.3 mol·L－1FeSO4各 30 μl，37℃水浴 30 min;迅速放于冰上，加入 300 μl乙酸乙酯，渦旋振蕩 15 s，4℃、12 000 × g離心8 min，取上層有機相用于ESR測定。測試條件:中心磁場3 385G，掃寬400 G，功率20 mW，放大倍數4×105。

1.4 Western blot檢測 iNOS、HSP70 蛋白表達將細胞用預冷PBS沖洗3次，棄去PBS后將培養板置于冰上，每孔加入100 μl裂解液，冰上裂解30 min，迅速將細胞刮下置于離心管中，12 000 r·min－1離心10 min，收集上清，測蛋白質濃度。每孔上樣約40 μg蛋白質，SDS-PAGE電泳;蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上，封閉液室溫封閉1 h;加入一抗4℃孵育過夜;TBST洗滌3次后加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h;TBST洗膜3次后以二氨基聯苯胺(DAB)顯色。

1.5 統計學分析用SPSS 12.0軟件進行單因素方差分析及q檢驗。

2 結果

2.1 UVB照射HaCaT細胞后NO的釋放及PCF對釋放的影響待細胞融合至0.60～0.80時進行UVB 照射，照射后 1、3、12、18、24 及 30 h 分批次收集細胞。PCF組于照射前2 h加入2.84 mmol·L－1PCF。ESR檢測NO的釋放，NO釋放量以3個NO釋放波峰值的平均值表示。結果如Fig 1所示，UVB照射后1 h NO釋放即開始增加，3 h達高峰，12 h時釋放減少但仍明顯高于對照組(P＜0.01)，18 h時NO釋放量又開始增加，24 h時達第二峰值，30 h時下降。PCF組與相應各時間點的UVB照射組比較NO釋放量均明顯減少(P＜0.05，P＜0.01)。

2.2 UVB照射HaCaT細胞后iNOS表達的經時變化UVB 照射后 0.5、1、3、6、12、18、24 h 分批次收集細胞，Western blot檢測iNOS蛋白表達。結果如Fig 2所示，UVB照射后6 h iNOS蛋白表達開始逐漸升高，18～24 h達到高峰。

Fig 1 Effect of PCF on NO release of HaCaT cells after UVB radiation(±s，n=3)

Fig 2 The changes of iNOS protein expression after UVB radiation in HaCaT cells

2.3 iNOS抑制劑對UVB照射HaCaT細胞后NO釋放的影響實驗分為正常對照組(3、24 h)、UVB照射組(3、24 h)及 iNOS抑制劑組(3、24 h)。待細胞融合至0.60～0.80時進行UVB照射，iNOS抑制劑組于照射前2 h加入1 mmol·L－1SMT。ESR檢測NO的釋放，從Fig 3可以看出，iNOS抑制劑3 h組NO的釋放量與UVB照射3 h組相比無差別，24 h時，iNOS抑制劑組與UVB組相比NO的釋放明顯減少(P＜0.01)。

2.4 PCF對HaCaT細胞HSP70蛋白表達的影響細胞分組如下:正常對照組、UVB模型組、UVB+1.42 mmol·L－1PCF 組(PCF1)、UVB+2.84 mmol·L－1PCF 組(PCF2)、UVB+5.69 mmol·L－1PCF組(PCF3)。PCF組于照射前2 h分別加入各劑量PCF，照射后 12 h收集細胞，Western blot檢測HaCaT細胞中HSP70蛋白表達。蛋白表達水平以HSP70與β-actin光密度比值表示。結果如Fig 4所示，與對照組相比，UVB組HSP70表達明顯升高，各劑量PCF組HSP70表達較UVB組明顯升高且呈劑量依賴關系(P＜0.05)。

Fig 3 Effect of iNOS inhibitor on NO release after UVB radiation in HaCaT cells

Fig 4 Effect of PCF on UVB-induced HSP70 expression in HaCaT cells(±s，n=3)

3 討論

ESR技術直接檢測UVB照射HaCaT細胞后NO的經時釋放情況，結果發現，20 mJ·cm－2的UVB照射早期NO的產生即開始增多，在1 h及3 h時出現高峰，12 h則下降并且在18 h又逐漸增多，24 h達第二次高峰。UVB是如何引起NO產生增多的?眾所周知，iNOS可催化L-精氨酸合成NO。本研究顯示，在UVB照射后6 h，HaCaT細胞內的iNOS蛋白開始表達，并逐漸升高，18～24 h達高峰。與NO經時釋放情況相比較發現，NO產生的第2次高峰期(24 h)與iNOS高表達的時間點一致，說明NO釋放的第2次高峰可能是由UVB照射后iNOS表達的增加引起。但在NO的第1次釋放高峰期(1～3 h)未檢測到iNOS的高表達，那么此時細胞中的NO是如何產生的呢?有研究指出［2］，雖然皮膚細胞中的NO是由NOS催化產生的，但是在UVA輻射后，也能以非NOS依賴的形式氧化并釋放大量NO。因此可以推測，在UVB損傷初期，HaCaT細胞可能通過非iNOS途徑生成NO，例如其他酶催化的亞硝基或其他含氮化合物的氧化。采用iNOS抑制劑SMT預孵育細胞可明顯減少24 h時NO的釋放量，但對3 h時NO的釋放無影響，此結果進一步驗證了上述推測的可能性。

PCF作為一海洋天然抗氧化劑，其抗紫外線氧化損傷的作用已得到證實［3－4］。在本研究中，與PCF預孵育的HaCaT細胞經UVB照射后，在各時間點NO的釋放量均低于模型組，表明PCF可有效抑制NO的釋放。UVB照射后期PCF對NO釋放的影響可能與其抑制iNOS的表達［5］，從而抑制NO的生成有關，但其對UVB照射早期NO的抑制作用表明，PCF還可能通過其他途徑抑制NO的釋放，尚待進一步的研究。

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一組結構上高度保守的多肽，環境中各種有害刺激可誘導HSP的產生而啟動細胞內源性保護機制。研究發現［6］，HSP70高表達能有效抑制UVC誘導的A549細胞DNA損傷，抑制UVB誘導的黑色素瘤細胞caspase-3活化及 PARP的裂解，從而抑制凋亡［7］。本研究中，經20 mJ·cm－2的UVB損傷HaCaT細胞后，HSP70表達水平明顯升高，說明UVB在誘導DNA損傷和細胞凋亡的同時也通過促進HSP70基因表達而產生細胞內適應性保護機制。在UVB照射前分別加入各劑量PCF，HaCaT細胞HSP70的表達與UVB照射組相比均增加，說明PCF可通過上調HSP70的表達而起到保護作用。

Kiang等［8－9］研究認為，HSP70 能夠與轉錄因子KLF6結合形成復合物，減少KLF6與iNOS啟動子的結合，從而降低了iNOS蛋白表達、抑制NO的產生而對細胞起保護作用。本實驗室前期研究已證實，PCF可有效抑制UVB誘導的HaCaT細胞iNOS表達［5］，綜合本次實驗結果可以推測，PCF可能通過增強UVB照射后HSP70的表達，進而抑制iNOS蛋白表達、減少NO的生成而保護HaCaT細胞免受UVB輻射損傷。

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