憤怒、郁怒反應模型大鼠海馬5-HTR2C的基因表達

王杰瓊，張惠云

(山東中醫藥大學中醫藥經典理論教育部重點實驗室，山東濟南 250355)

情志與健康和疾病的關系，尤其是負性情緒對健康和疾病的影響已成為當今全社會關注的焦點。中醫七情中怒是負性情緒中最不可忍受、對人際關系與社會和諧影響最大、與疾病發生關系最為密切的情緒反應之一。喬明琦等［1］認為怒有憤怒和郁怒兩種形式，憤怒表現為發怒后向他人發泄，郁怒表現為發怒后不發泄而郁于心中。Bridewell等［2］認為憤怒和郁怒分別對焦慮和抑郁及其相關癥狀產生起重要作用。為探索憤怒、郁怒誘發病證的具體機制，我們通過基因芯片技術大規模、高通量檢測憤怒、郁怒模型大鼠及藥物處理模型大鼠的海馬基因表達，發現:憤怒、郁怒情志可導致海馬多種基因的表達水平改變，本文通過RT-PCR和Western blot檢測5-HTR2C在大鼠海馬中mRNA和蛋白水平，從而為下一步的研究提供方向和線索。

1 材料與方法

1.1 動物及模型制備

1.1.1 動物 ♂Wistar大鼠，180 ～220 g，50 只，均由山東中醫藥大學實驗動物中心提供，生產許可證號:SCXK(魯)20050015。

1.1.2 憤怒、郁怒大鼠模型制備 憤怒大鼠模型制備采用居住入侵結合社會隔離［3］的方法，分為正常組，憤怒、郁怒模型組，經前平、經前舒給藥組，每組10只。

1.2 主要試劑經前平顆粒(揚子江藥業集團四川海蓉藥業有限公司生產，生產批號:07102501)、經前舒顆粒(秦皇島市山海關制藥廠生產，生產批號:Z20053587)。UNIQ-10柱式總RNA抽取試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)、RNase Inhibitor(日本TOYOBO公司);RT-PCR反應試劑包括MMLVReverse、dNTP Mixture、rTaq、DNase I(大連TaKaRa生物公司)。引物合成由濟南博亞生物工程技術服務有限公司完成。5-HTR2C一抗(sc-1464)、β-actin一抗(sc47778)均購自美國Santa Cruz公司;驢抗羊二抗(美國Santa Cruz公司);驢抗兔二抗(美國Abcam公司);預染蛋白marker(Thermo Fisher Scientific公司);protease inhibitor cocktail(美國Sigam公司);BeyoECL Plus購自碧云天生物技術研究所。

1.3 大鼠腦組織取材共有5組大鼠(n=10/組):正常組、憤怒組、憤怒用藥組、郁怒組、郁怒用藥組。每只大鼠被斷頭、開顱、分離腦置于冰上培養皿中，無菌操作取出海馬，分別置于Ep管中，液氮保存。

1.4 大鼠密切相關基因確定

1.4.1 大鼠基因芯片檢測 選5組大鼠右側海馬，干冰保存運輸至上海生物芯片有限公司/生物芯片上海國家工程研究中心。選用Affymetrix大鼠基因組芯片，由上海生物芯片有限公司/生物芯片上海國家工程研究中心完成芯片檢測及數據統計。結果采用Affymetrix掃描儀進行掃描，GCOS 1.4軟件讀取、處理數據。與正常組大鼠相比較，差異基因篩選標準是Log2信號比值≥0.8(即基因表達水平比值≥1.74)。在初始數據基礎上，運用專業軟件分別進行pathway、GO、GSEA等進一步的統計分析。

Tab 1 Primer sequences and the product lengths

1.4.2 明確密切相關基因 根據基因芯片初始數據和初步統計分析結果，通過查閱文獻，比對基因，初步明確分別與憤怒和郁怒密切相關基因:5-HTR2C、GABABR2和 5-HTR3B。本文僅對 5-HTR2C在大鼠海馬中的表達做進一步研究。

1.5 大鼠海馬中5-HTR2C基因表達水平檢測

1.5.1 RT-PCR檢測5-HTR2C在大鼠海馬中 mRNA表達變化 用TRIzol法提取大鼠海馬總RNA，測定其濃度后，－80℃保存。參照M-MLV反轉錄酶說明書進行反轉錄，根據目的cDNA序列，用引物設計軟件(primer 3)設計引物，由濟南博亞生物工程技術服務有限公司合成。建立20 μl PCR反應體系:2.5 mmol·L－1dNTP 2.0 μl，10 × PCR buffer 2.0 μl，上游引物 0.3 μl，下游引物 0.3 μl，模板 cDNA 1.0 μl，5 U/μl rTaq 聚合酶 0.2 μl，ddH2O 14.2 μl。PCR反應條件為預變性94℃ 3 min，變性94℃ 30 s，退火40 s，延伸72℃ 1 min，不同循環數，再72℃延伸7 min。引物序列及退火溫度和最佳循環數見Tab 1。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀成像。以β-actin作為內參按照下列公式計算各基因的mRNA相對表達水平:被檢測基因表達水平=被檢測基因電泳條帶光密度值/β-actin電泳條帶光密度值。

1.5.2 Western blot檢測

1.5.2.1 蛋白提取及定量 取出海馬，冰浴中操作，按1∶5的比例(mg·μl－1)加入提前預冷的RIPA裂解液(含0.01 mol·L－1的 PMSF和 cocktail)，勻漿器勻漿 30 min，4℃ 下12 000 r·min－1離心 5 min，取上清，采用Bradford法測定蛋白含量，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×，置于沸水中煮5 min 使蛋白變性，12 000 r·min－1離心 5 min，取上清，－20℃保存。

1.5.2.2 Western blot檢測 以30 ～50 μg/泳道上樣，經SDS-PAGE電泳分離后，濕法轉移至 NC膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h，分別與5-HTR2C 一抗(ab44635，1 ∶200)、β-actin一抗(M1821，1∶1 500)室溫搖床孵育2 h(抗體均用5%脫脂奶粉的TBST溶液稀釋)，TBST洗膜3次，10 min/次，再與辣根氧化酶標記的相應二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，10 min/次，ECL化學發光試劑檢測雜交信號，顯影于X線片上，用凝膠成像分析儀在可見光透射下對X線片進行掃描和圖像分析。5-HTR2C與內參β-actin做灰度比值，以此作為所測樣品中相應指標的相對表達量。

1.6 數據統計方法利用SPSS 16.0統計軟件，單因素方差分析及LSD檢驗法統計數據。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測5-HTR2C在大鼠海馬中mRNA表達水平以β-actin作為內參，5-HTR2C mRNA表達量的光密度掃描顯示，與正常組相比較，5-HTR2C mRNA相對水平在憤怒組大鼠海馬中增加(P＜0.01)，在郁怒組海馬中增高(P＜0.01)，憤怒組大鼠海馬中5-HTR2C mRNA相對表達水平改變明顯強于郁怒組大鼠;用藥后，與模型組相比較，5-HTR2C mRNA改變得到改善(Fig 1、2)。

Fig 1 The expression of 5-HTR2C mRNA in hippocampal of rats

Fig 2 The expression of 5-HTR2C mRNA in hippocampal of rats

2.2 Western blot檢測大鼠海馬的5-HTR2C蛋白水平以β-actin作為內參，5-HTR2C蛋白表達量的光密度掃描顯示，與正常組相比較，5-HTR2C蛋白相對水平在憤怒組大鼠海馬中增高(P＜0.01)，在郁怒組大鼠海馬中增高(P＜0.01);用藥后，與模型組相比較，給藥組大鼠海馬的5-HTR2C蛋白改變均得到改善(Fig 3、4)。

Fig 3 The protein expression of 5-HTR2C mRNA in hippocampal of rats

Fig 4 The expression of 5-HTR2C mRNA in hippocampal of rats

3 討論

前期研究顯示，面對經歷的生活事件，有人憤怒發火，有人則郁怒生悶氣，進而呈現肝疏泄太過或不及相應癥狀［4］。嚴燦等［5］認為，肝主疏泄之所謂“疏泄”，其中樞神經生物學機制在整體上與調節下丘腦—垂體—腎上腺軸有關，表現出多層次、多靶點以及多環節的作用特點;作用的腦區涉及到下丘腦(包括不同核團)、海馬、杏仁核等。據報道［6］海馬是學習記憶功能的關鍵腦區，故對相關基因進行深入研究。

3.1 基因芯片篩選憤怒、郁怒相關基因本次研究中，運用基因芯片技術檢測了憤怒、郁怒模型大鼠及藥物干預模型大鼠海馬的基因表達情況。基因芯片選用了Affymetrix大鼠基因組芯片，以大鼠海馬提取的總RNA中的mRNA為模板，通過RT-PCR反應生成cDNA，與芯片進行雜交反應。檢測結果顯示:憤怒組中5-HTR2C基因表達差異性增高、GABAR2B基因差異性降低，郁怒組中5-HTR3B基因表達差異性增高。已有的報道顯示，上述3個基因與焦慮、易激惹、狂躁易怒、抑郁均有關［7－10］。這不僅從側面證明了模型制備的有效性，更提示憤怒、郁怒情志誘發病證機制涉及上述3個基因及其相關信號通路，從而為下一步的研究提供了線索和初步依據。本次研究僅對5-HTR2C基因表達做進一步的探索。

3.2 檢測5-HTR2C在模型組大鼠海馬的mRNA和蛋白表達水平5-HTR2C作為5-HT受體之一，屬于G蛋白偶聯受體，在嚙齒類動物中樞神經系統內分布較廣，脈絡叢、下丘腦、紋狀體、額區皮質、海馬、杏仁核等均有表達［11］。近年來的報道證實該基因與情緒關系密切。5-HTR2C可以抑制去甲腎上腺素和多巴胺的釋放［12］，從而調節情緒、焦慮、攝食和生殖行為［13］。

從 RT-PCR結果可看出:與正常組相比，5-HTR2C mRNA的相對水平在憤怒組和郁怒組大鼠海馬內增高(P＜0.01)，而且憤怒組的改變程度明顯大于郁怒組，表明5-HTR2C與憤怒的相關性更大。Western blot的結果顯示:5-HTR2C蛋白水平在憤怒組與郁怒組大鼠海馬的改變趨勢與其mRNA的改變一致，但改變程度相對小，說明該基因的表達水平改變主要在基因轉錄階段。同時也說明憤怒、郁怒作為怒的兩種不同形式，在導致5-HTR2C水平改變的腦區方面以共性為主，但與大鼠憤怒更為相關。

另外，本實驗中運用了調肝方藥經前平與經前舒顆粒分別干預憤怒和郁怒情緒反應模型大鼠。由結果可看到，模型用藥組與模型組相比較，各項指標絕大多數差異都呈顯著性，與正常組相比較差異則無顯著性，說明用藥后能改善造模對5-HTR2C表達水平的影響，使其基本恢復正常，所用調肝方藥干預效果明顯。同時，也從側面證實，憤怒、郁怒情緒均與肝功能失常有關。

綜上所述，5-HTR2C是憤怒/郁怒情緒反應大鼠模型的密切相關基因，調肝方藥可有效干預上述憤怒/郁怒大鼠模型5-HTR2C的表達，使其基本恢復正常水平，說明5-HTR2C是兩種調肝方藥的作用靶點。

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