PUMA介導大鼠缺氧/復氧心肌細胞凋亡的研究

付晶晶，段 榮，李 紅，萬福生

(1.南昌大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，江西南昌 330006;2.江西省兒童醫院檢驗科，江西 南昌 330006)

缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，IRI)即缺血組織恢復血液灌注后，器官超微結構、代謝及功能反而進一步損傷的現象。多種組織器官再灌注時均存在 IRI，但以心肌最為明顯和嚴重［1］。眾多研究表明［2］，凋亡引起的心肌細胞損失是心臟IRI的重要病理特征。因此，深入研究心肌IRI中誘導心肌細胞凋亡的機制，對有效防治心肌IRI具有重要的現實意義。p53上調凋亡調制物(p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA)是迄今發現的促凋亡作用最強的BH3-only蛋白［3］。已有文獻報道，短暫的前腦缺血會導致大鼠海馬神經細胞組織PUMA表達明顯上升［4］;而在小腸IRI損傷中也發現PUMA上調并通過激活線粒體凋亡通路介導細胞凋亡，通過敲除PUMA可以減少腦缺血及小腸IRI損傷中的細胞凋亡［5］。但PUMA是否介導心肌IRI中的心肌細胞凋亡，目前國內外報道甚少。本實驗采用原代大鼠心肌細胞H/R損傷模型模擬在體心肌IRI，重點觀察PUMA在大鼠缺氧/復氧心肌細胞凋亡中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Sparage Dawley 0～3 d齡大鼠，由南昌大學實驗動物科學部提供。

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖培養基、胎牛血清購自Gibco公司;逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司;PCR引物由上海生物技術服務公司合成;AnnexinⅤ-FIFC/PI試劑盒購自南京凱基公司;Caspase-3檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所;PUMA抗體(ab9643)購自Abcam公司;β-actin抗體(sc-1616)、Bcl-2抗體(sc509)、Bax抗體(sc20067)購自 Santa Cruz公司;HRP標記的二抗購自北京中杉金橋公司;LipofectamineTM2000、TRIzol購自 Invitrogen公司;PUMA特異性 siRNA(si-PUMA)和陰性對照scramble siRNA(si-SCR)由廣州銳博生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心肌細胞H/R損傷模型的制備及實驗分組 參考本實驗室已建立的方法［6］，將原代培養3 d的心肌細胞，用預先經95%N2和5%CO2混和氣體飽和過的缺氧液置換正常培養液，將培養板置于95%N2，5%CO2持續通氣的缺氧密閉容器中(37℃)培養5 h即為缺氧;再用預先經95%O2和5%CO2混和氣體飽和過的正常培養液置換缺氧溶液，放置CO2培養箱(5%CO2，37℃)進行復氧培養即為復氧。實驗分5組:正常對照(Control)組、H/R 2 h組、H/R 4 h組、H/R 6 h組、H/R 12 h組。每組重復3次。

1.2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率 將各實驗組心肌細胞制備成單細胞懸液，4℃預冷PBS液潤洗2次，按照測試盒說明分加入染料AnnexinⅤ、PI，室溫下避光孵育15 min，上機(美國 Becton Dickinson，Facscallbar型流式細胞儀)檢測細胞凋亡情況。

1.2.3 心肌細胞Caspase-3活性 采用分光光度法檢測各組心肌細胞Caspase-3活性，按試劑盒說明書操作。

1.2.4 siRNA 基因轉染 參考劉丹等［7］的方法，將培養2 d搏動良好并融合至培養板60%左右的大鼠心肌細胞，進行siRNA轉染。具體操作參照LipofectamineTM2000試劑說明書建議的劑量和步驟進行。轉染心肌細胞24 h后，制備大鼠心肌細胞H/R損傷模型，具體操作方法同前。

1.2.5 RT-PCR 常規方法提取各組心肌細胞總RNA后，RT-PCR法檢測PUMA及凋亡相關基因Bax、Bcl-2在mRNA水平的表達。PUMA上游引物:5＇-AGCGGCGGAGACAAGAA-3＇，下 游 引 物:5＇-CAAGT CCGTATCTCCATCAGTG-3＇，擴增長度為 323 bp;Bax 上游引物:5＇-CATCCAGGATCGAGCAGA-3＇，下游引物:5＇-CAAAGTAGAAGAGGGCAACC-3＇，擴增長度為 260 bp;Bcl-2上游引物:5＇-GGGATACTGGAGATGAAGACT-3＇，下游引物:5＇-CCACCGAACTCAAAGAAGG-3＇，擴增長度為367 bp;GAPDH上游引物:5＇-GCAAGTTCAACGGCACAG-3＇，下游引物:5＇-AGGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3＇，擴增長度為723 bp。取擴增PCR產物5 μl上樣，1.5% 瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠0.5 mg·L-1)電泳后，凝膠成像系統拍照分析，以目的基因產物帶與GAPDH產物帶的綜合灰度之比，除以Control組相對應樣本的此兩條帶綜合灰度之比，反映目的基因mRNA相對水平。

1.2.6 Western blot 實驗處理后加入適量預冷的蛋白裂解液提取總蛋白，用Bradford法測定蛋白定量后，取等量蛋白質進行SDS-PAGE電泳和電轉移至PVDF膜，再先后結合一抗和二抗后，ECL顯色曝光，顯影，定影。將膠片掃描后，用凝膠分析系統軟件進行分析處理。以目的基因產物帶與β-actin產物帶的綜合灰度之比，除以Control組相對應樣本的此兩條帶綜合灰度之比，反映蛋白相對水平。

2 結果

2.1 H/R后心肌細胞凋亡率及Caspase-3活性的變化如Tab 1所示:正常培養的心肌細胞凋亡率很低，H/R后心肌細胞凋亡率明顯上升，其中H/R 6 h組凋亡率最高;設定Control組Caspase3活性為1，H/R處理后心肌細胞Caspase-3活性升高，H/R 12 h達峰值。H/R各組凋亡率及Caspase-3活性與正常對照(Control)組相比差異有統計學意義(P＜0.05)。

Tab 1 The effects of H/R on cardiomyocyte apoptosis rate and Caspase-3 activity(±s，n=3)

Tab 1 The effects of H/R on cardiomyocyte apoptosis rate and Caspase-3 activity(±s，n=3)

*P ＜0.05 vs control group

Group Apoptosis rate/% Caspase3 activity(fold of control)Control 3.12 ±0.46 1 H/R 2 h 14.25 ±2.57* 1.98 ±0.28*H/R 4 h 18.62 ±3.46* 3.11 ±0.33*H/R 6 h 23.44 ±4.16* 4.19 ±0.36*H/R 12 h 20.30 ±3.91* 4.57 ±0.48*

2.2 H/R誘導PUMA及凋亡相關基因mRNA水平的表達變化如Fig 1所示:PUMA mRNA H/R 2 h開始升高(0.45 ±0.05)，6 h 達峰值(0.76 ±0.06)，持續到 12 h(0.71 ±0.07)仍高于正常對照(Control)組(0.29 ± 0.02)(P ＜ 0.05);Bax mRNA在 H/R 2 h 開始升高(0.63 ±0.07)，6 h 達峰值(0.96 ±0.09)，持續到12 h(0.79 ±0.09)仍高于正常對照(Control)組(0.28 ±0.05)(P ＜0.05);與正常對照(Control)組(0.97 ±0.08)相比，Bcl-2 mRNA H/R 2 h 開始下降(0.82 ±0.07)，12 h 降至最低(0.47 ±0.05)(P ＜0.05)。

Fig 1 mRNA expression of PUMA/Bax/Bcl-2 induced by H/R( ± s，n=3)

2.3 H/R誘導PUMA及凋亡相關基因蛋白水平的表達變化如Fig 2所示:正常對照(Control)組PUMA 蛋白的表達量很低(0.08 ±0.01)，H/R 4 h出現明顯上調(0.33 ±0.04)，6 h 升高(0.68 ±0.07)，12 h 達峰值(0.72 ±0.07)與正常對照(Control)組相比差異有顯著性(P＜0.05);Bax蛋白復氧后2 h 開始升高(0.49 ±0.05)，6 h 明顯升高(0.92±0.08)，12 h 達峰值(0.97 ± 0.10)與正常對照(Control)組(0.28±0.04)相比差異有顯著性(P ＜0.05);與正常對照(Control)組(0.68 ±0.07)相比，H/R處理后Bcl-2蛋白表達量呈遞減趨勢，復氧2 h開始降低(0.56 ±0.06)，12 h 降至最低(0.26 ±0.02)差異有統計學意義(P ＜0.05)。

Fig 2 Protein expressions of PUMA/Bax/Bcl-2 induced by H/R(±s，n=3)

2.4 靶向PUMA的siRNA轉染對Bax、Bcl-2蛋白表達的影響如Fig 3所示:si-PUMA組Bax表達明顯下調(0.64 ±0.05)，與 H/R 6 h 組(1.06 ±0.07)相比差異有顯著性(P＜0.05);而Bcl-2表達上調(0.68 ±0.08)，與 H/R 6 h 組(0.52 ±0.06)相比差異有顯著性(P＜0.05);轉染陰性對照si-SCR組與H/R 6 h組Bax/Bcl-2蛋白水平相比差異無統計學意義(P ＞0.05)。

Fig 3 The effect of extrogenous interference of PUMA on protein expressions of Bax/Bcl-2(±s，n=3)

3 討論

大量研究已證實，凋亡是造成心肌IRI中心肌細胞丟失的重要原因，它可導致梗死面積擴大，參與心肌重構及向心力衰竭轉化［8］。因此，心肌IRI中凋亡機制的研究多年來一直是現代心臟病學的研究熱點和重點。

PUMA是近年發現的Bcl-2家族中BH3-only促凋亡蛋白亞家族成員，在多種病理應激的情況下，PUMA可通過典型的p53依賴凋亡途徑和非p53依賴凋亡途徑被迅速轉錄激活［9］。由于 PUMA的BH3結構域幾乎能夠中和所有Bcl-2抗凋亡蛋白質作用而激活Bax/Bak，因此被譽為“線粒體凋亡通路的中心”［10］。本實驗結果表明，PUMA在正常培養的心肌細胞中表達很低，但當心肌細胞遭受H/R損傷刺激后，PUMA表達隨即出現上調，其表達變化與心肌細胞凋亡率、Caspase-3活性及凋亡相關蛋白Bax的上調表達及Bcl-2的下調表達變化趨于一致。靶向PUMA的siRNA轉染后，Bax上調表達及Bcl-2下調表達的程度明顯被抑制，進一步證明PUMA通過作用Bcl-2及Bax激活線粒體凋亡途徑以介導心肌細胞凋亡。本實驗結果提示人們可以通過基因治療或是藥物干預的方式，在適當程度上遏制PUMA表達以減少心肌細胞凋亡，達到減輕心肌IRI的目的。

除了線粒體凋亡途徑，本實驗中PUMA的激活可能還存在其他機制。PUMA對應激刺激非常敏感，在多種細胞系中觀察到血清饑餓或生長因子剝奪會造成PUMA表達上調［11］。本實驗心肌細胞H/R損傷模型中，存在一定程度的血清饑餓或生長因子剝奪，推測其可能是激活PUMA上調的原因之一;第二，Nickson在衣霉素誘導的心肌細胞內質網應激模型中發現PUMA表達上調，用靶向缺失PUMA的方式可以將心肌細胞從內質網應激誘導的細胞凋亡中拯救回來［12］，說明PUMA正是介導內質網應激誘導心肌細胞凋亡的關鍵分子，而過度的內質網應激正是心肌IRI向心衰轉化的主要因素［13-14］，所以后續本實驗研究將通過協調內質網應激的重要調節子如 CHOP、JNK及 caspase-12/4，觀察 PUMA的表達變化，進一步深入研究PUMA介導H/R心肌細胞凋亡的具體機制。

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