eNOS磷酸化與酶活性及中藥介入

史海霞，劉 俊，薛永亮，俞林花，聶緒強，卞 卡，2

(1.上海中醫藥大學穆拉德中藥現代化研究中心，上海 201203;2.美國德克薩斯大學休斯敦醫學院綜合生物及藥理學系，德克薩斯大學分子醫學研究所，休斯敦 TX77030)

血管內皮細胞位于循環血液和血管平滑肌之間，在調節血管功能、維持血管穩態和防止心腦血管疾病中起著至關重要的作用。在病理狀態下，以內皮依賴性血管舒張功能下降、血管通透性增加、炎癥反應、內皮細胞脫落等為主要表現的血管內皮功能紊亂是諸多循環系統疾病如高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病、腎病等共同的始動因素及病理基礎。內皮源性一氧化氮(NO)作為重要的內皮功能調節因子，其保護效應主要是通過調節血管張力和血壓，抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移，抑制血小板聚集，抑制單核細胞和血小板的黏附等作用來實現的［1］。NO合成是內皮源性一氧化氮合成酶(eNOS)以L-精氨酸(L-Arginine)和分子氧(O－)為底物，還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)提供電子，經由黃素單核苷酸(FMN)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和四氫生物蝶呤(BH4)傳遞電子，生成中間體對羥基-L-精氨酸，經進一步氧化最終形成NO和L-胍氨酸。

eNOS存在于內皮細胞、心肌細胞、血小板以及肥大細胞、腎上皮組織等實質細胞中。由于eNOS在細胞內呈構成型表達，對eNOS的調控研究多集中于翻譯后的蛋白水平的調控［2］。本文就近年來對eNOS的翻譯后修飾及其活性調控做一綜述。

1 eNOS

在哺乳動物，NOS有3種亞型:nNOS、iNOS和eNOS。他們分別是不同基因的產物，且有50% ～60%的序列同源性。eNOS作為同源二聚體，每個亞基由N端的氧化酶區和C端的還原酶區組成;在eNOS的催化反應中，電子在還原酶區穿梭移動，連續不斷地從NADPH到FAD，最后到FMN。因為電子的轉移從eNOS一個單聚體的還原酶區到另一個單聚體的氧化酶區，因此，酶的二聚體化是酶完全活化的前提［3－4］。

2 eNOS蛋白的翻譯后修飾

eNOS的翻譯后修飾有著復雜的模式。在生理刺激和病理狀態下，翻譯后修飾動態調控酶的活性［5－7］。這些修飾包括:酰化作用［8］;鈣/鈣調素的結合［9－10］;磷酸化;S-亞硝基化［11－12］。鑒于蛋白激酶和磷蛋白磷酸酶介導的磷酸化和去磷酸化網絡是調節eNOS活性的主要的翻譯后修飾［2，13］，因此，本文主要闡述eNOS不同氨基酸殘基的磷酸化和去磷酸化對其活性的調控及其分子機制。

2.1 eNOS的磷酸化調控目前研究表明，eNOS的磷酸化可以發生于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸位點，拓寬了eNOS活性調節中磷酸化的潛在作用。雖然據推測存在眾多的磷酸化位點，但是最經典的功能性的磷酸化序列是位于還原酶區的絲氨酸位點(人的eNOS Ser1177、牛的eNOS Ser1179)和位于鈣調素結合區的蘇氨酸位點(人的eNOS Thr495、牛的eNOS Thr497)［2］。此外還包括:Ser635，Ser617和 Tyr83的磷酸化上調eNOS的酶活性，eNOS Ser116、Thr495和 Tyr653磷酸化則下調eNOS 的活性［14］(Fig 1)。

2.1.1 上調eNOS活性的磷酸化位點及相關信號通路Ser1177:在未經刺激的內皮細胞，Ser1177位點并非磷酸化狀態，但是在刺激因素如流體切應力［15－16］、血管內皮生長因子(VEGF)［17－18］和緩激肽［19］作用下則發生迅速的磷酸化。eNOS Ser1177位點磷酸化激活eNOS的催化功能的機制是由于抑制了CaM從eNOS的解離和上調了eNOS酶內部的電子轉移率［20］。在此過程中，因刺激因素不同對eNOS激活所涉及信號通路各不相同，如流體切應力刺激eNOS Ser1177磷酸化是通過蛋白激酶A(PKA)信號通路;而胰島素、雌激素和VEGF則主要通過Akt信號通路使eNOS發生該位點的磷酸化;心肌缺血通過AMPK信號通路使eNOS Ser1177磷酸化［21］;另一方面，緩激肽、鈣離子載體以及毒胡蘿卜素所介導的eNOS Ser1177的磷酸化，則是由鈣調素激酶Ⅱ(CaMKⅡ)介導的［19，22］。

Fig 1 Overview of principal eNOS post-translational modifications

有研究表明，在體外，高血糖［23］和葡萄糖造成的白蛋白終末期糖基化終產物［24］，類似于人的 2型糖尿病［25］，可以通過氧結合的N-乙酰基糖基化修飾eNOS Ser1177。相對于未經過糖基化修飾的蛋白，以這種方式修飾的蛋白易于磷酸化不足，并且可能通過掩蓋磷酸化位點而引起eNOS的活性下降，使得NO的生成減少。

Ser635:Ser635定位于自抑制環內，被認為呈折疊狀態以阻礙鈣調素的結合，從而抑制酶的活性。有體外研究提示Ser635可以通過PKA和PKG通路被磷酸化［26］，但在NO的生成過程中，Ser1177的磷酸化起關鍵作用而Ser635的磷酸化未檢測到或結果不明顯［15－16］。最近，有研究表明［27－28］在流體切應力、VEGF、緩激肽和8-bromocAMP刺激下，Ser635通過PKA信號通路發生緩慢的磷酸化，磷酸化速率要慢于Ser1177和Thr495。

Ser617:此位點的磷酸化是通過磷光肽鏈圖譜法識別的，機制涉及PKA和Akt信號通路。模擬Ser617位點的磷酸化可以明顯增加eNOS對Ca2+/CaM的敏感性，但未報道能改變酶的最大活性［28］。但是，Ser617也許在調節其他位點的磷酸化中起重要作用，如蛋白－蛋白間的相互作用［29］。

Tyr83:氧化應激和v-Src過表達可以介導eNOS氧化酶區的Tyr83發生磷酸化［30］。這種修飾可以上調原位的NO輸出，但是在體外實驗中，野生型和此位點苯丙氨酸突變的eNOS酶活性并無差別，因此，似乎Tyr83位點的磷酸化并非直接調控eNOS的活性，也許是通過調節酶對鈣離子的敏感性、蛋白－蛋白之間的相互作用或改變eNOS的亞細胞定位而實現的。新近實驗證實，在原代和培養的內皮細胞中，Src依賴的eNOS Tyr83磷酸化可以由激動劑毒胡蘿卜素、VEGF、緩激肽、ATP、磷酸神經鞘脂、雌激素、血管形成素和乙酰膽堿所誘導［31］。至此，盡管不同的 eNOS激動劑均可以介導Tyr83位點的磷酸化，但此磷酸化位點的具體改變及相關的分子機制，尚有待探索。

2.1.2 下調eNOS活性的磷酸化位點及相關信號通路Ser116:此位點呈結構性磷酸化。有研究表明，一條涉及磷酸酶神經鈣蛋白的信號通路使Ser116位點的去磷酸化而激活eNOS。免疫抑制劑環孢素A抑制神經鈣蛋白(Calcineurin)，阻斷VEGF介導的Ser116位點的去磷酸化，這一潛在的機制也許可以為其引起高血壓的機制提供一個解釋［5，32－33］。

Thr495:該調節位點呈結構性磷酸化表達于所有內皮細胞并下調酶的活性［19，32，34］，其機制是由于該位點的磷酸化阻礙了鈣調素與其結合位點的結合。促使Thr495磷酸化的激酶很可能是 PKC［18－19，35］，因為 PKC 抑制劑和下調 PKC 可以明顯增加內皮細胞生成NO的量［36］。有報道稱在體外實驗，Thr495位點的磷酸化可以通過血管形成素-1(angiopoietin-1)依賴的方式抑制VEGF誘導的內皮細胞通透性增加［37］;糖尿病和吸煙也以此機制介導eNOS活性的下調［38］。與此相反，刺激因素(如緩激肽、組胺和鈣離子載體)介導的Thr495位點的去磷酸化可以上調細胞內鈣水平，使eNOS活性上調。

Tyr657:應用質譜分析法明確了Tyr657定位于eNOS酶的FMN結合域，在細胞內磷酸化的同時c-Src或富含脯氨酸的酪氨酸激酶(PYK2)的表達上調［39］。PYK2被認為是誘導eNOS磷酸化的負性調控激酶，可以阻斷血流介導的NO依賴的頸動脈舒張［39］。最近研究發現，在AngⅡ誘導的高血壓模型，AT1受體和NOX-2依賴的PYK2活化抑制eNOS，再次證實了 eNOS Tyr657位點的磷酸化和 PYK2的激活有關［40］。有研究表明，在培養的內皮細胞，通過和eNOS免疫共沉淀檢測［41］的方法證實H2O2除了激活PYK2，還使蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2失活——一個失活PYK2從而可以潛在調控eNOS活性的蛋白［42－43］。人們推測作為PYK2介導的eNOS磷酸化的結果，eNOS的失活可能在動脈粥樣硬化的調節中起關鍵作用，也許在此病理狀態下PYK2充分活化而下調了eNOS的活性。

2.1.3 eNOS磷酸化的綜合調控網絡 一個世紀以前人們還簡單地認為eNOS的活化是緣于鈣/鈣調素的結合，此后，關于eNOS調控的其它機制與作用迅速增加，尤其是多種不同的激酶、不斷增加的相互作用蛋白以及亞細胞定位對eNOS絲氨酸和蘇氨酸磷酸化的調控。日益增長的認識逐漸向人們展示了一個復雜的eNOS活性調控網絡。緩激肽對eNOS活性的調控就是體現這一調控網絡的復雜性的很好的例子:緩激肽與B2受體結合刺激細胞內的鈣流，由此通過鈣調素的結合而激活eNOS，同時小窩蛋白-1(caveolin-1)從eNOS解離。此外，緩激肽還刺激eNOS和熱休克蛋白90(heat shok protein 90，hsp90)和細胞膜孔道蛋白的結合，減少eNOS與B2受體的結合。同時，緩激肽通過促進 eNOS Ser1177、Ser617、Ser635的磷酸化和 Thr495的去磷酸化而上調eNOS的活性，繼而促進NO的合成。蛋白激酶Akt、CaMKⅡ和PKA以及PP1、PP2B均參與了此磷酸化調控過程。緩激肽還可以瞬時地改變eNOS的亞細胞分布。所有這些同時發生的分子事件共同確保在合適的細胞定位及合適的時間介導適量的NO釋放。但是，這些事件之間的相互作用尚未完全闡明［13］。

2.2 中藥對eNOS磷酸化的調控Kang等［44］研究表明，中藥復方清活1號及其有效成分川芎嗪在bEnd.3、HUVEC及HAEC細胞均可以逆轉高糖誘導的eNOS Ser1177位點和Akt的磷酸化水平的下降，從而發揮其在糖尿病血管病變中的保護作用;郭玉等［45］實驗證實，金粉蕨素通過上調eNOS活性和ERK1/2的磷酸化水平而發揮抗氧化損傷作用。魏晉等［46］研究表明，(R，R)ZX-5能夠通過上調eNOS的表達和活力，增加NO的釋放，進而增加脈絡膜的血流。小檗堿(berberine)是黃連根莖中所提取出的生物堿，有研究表明［47］小檗堿可以濃度依賴性增強離體培養小鼠血管內皮細胞eNOS Ser1177的磷酸化，促進eNOS與hsp90的結合而增加NO的產生。

3 結語

近年來，隨著研究的逐漸深入，eNOS的活性調控呈現出一個復雜而精密的調控網絡。這也反映了NO系統的精密調控在維持循環系統健康中的重要性。心血管系統疾病如冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化等均存在NO的生物利用度不足的病理狀態。eNOS不同氨基酸殘基的磷酸化對其活性調控的機制亦各異，這些機制的闡明將有助于我們理解并利用這些機制開發改善內皮功能障礙的新藥。中藥及其有效活性成分在這些方面的深入研究尚較少，由于eNOS絲/蘇氨酸的磷酸化是一個快速反應的過程，如果能篩選出對這一調控機制有干預作用的中藥及其有效活性成分，將有助于發揮中藥對心血管系統的保護作用。

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