Nrf2/ARE信號通路及其調控的抗氧化蛋白

李 航，段惠軍

(河北醫科大學1.組織學與胚胎學教研室、2.病理學教研室，河北石家莊 050017)

氧化應激產生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)直接或間接地損傷細胞內蛋白質、脂質、核酸等大分子物質的生理功能，是眾多疾病發生的病理生理基礎。急性氧化應激包括缺血/再灌注、急性中毒等;慢性氧化應激包括癌癥、神經變性疾病、動脈粥樣硬化、糖尿病、衰老等。機體形成了一套復雜的氧化應激應答系統來應對自由基和有毒物質的損害:當暴露于親電子試劑或活性氧刺激時，機體自身能誘導出一系列的保護性蛋白，以緩解細胞所受的損害［1］。這一協調反應是由保護性蛋白DNA上游調節區的抗氧化反應元件(antioxidant responsive element，ARE)來調控的。而近年來的研究發現，核因子NF-E2相關因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)通過與ARE相互作用調節編碼抗氧化蛋白，是迄今為止發現的最為重要的內源性抗氧化應激通路［2］。

1 Nrf2

Nrf2蛋白分子量66 ku，在肝臟、腎臟等解毒器官以及皮膚、肺和消化道等暴露于外環境中的器官高度表達。Nrf2是cap'n'collar(CNC)轉錄因子家族成員，共有一高度保守的堿性亮氨酸拉鏈(leucime zipper bZIP)結構［3］。研究證實，Nrf2含有6個高度保守的結構域，命名為 Neh 1～Neh 6［4］(Fig 1)。

2 Keap1

生理狀態下，Nrf2在細胞質中與它的抑制蛋白果蠅肌動蛋白結合蛋白Kelch(Kelch-like ECH2 associated protein 1，keap1)結合，并通過Keapl蛋白將其錨定于由肌動蛋白構成的細胞骨架上，從而無法進入細胞核發揮轉錄活性［5］。對于Nrf2與Keap1的關系大多數學者的觀點是:生理狀態下，Keap1在細胞質內以二聚體的形式結合一個Nrf2分子，使之成為E3泛素連接酶的適配底物，促進Nrf2泛素化繼而被26 S蛋白酶體降解。這樣，在靜息狀態下，Nrf2就處于一種非游離并且不斷降解的非活性狀態;當受到親電試劑或ROS的刺激時，Keap1與Nrf2解偶聯使得Nrf2轉移入核，與基因中的Maf蛋白結合成異二聚體后識別并結合ARE，啟動下游保護性蛋白基因的轉錄，提高細胞抗氧化應激能力［6－7］。也有另外的觀點:在細胞質中，Keap1二聚體的兩個DGR區與Nrf2的DLG、ETGE區結合，并介導Nrf2的泛素化降解。當受到親電子試劑或ROS的刺激時，親和力較低的DLG區從DGR區解離，而ETGE區仍牢固地連接在DGR上，這樣，Nrf2就不能被泛素連接酶識別，但是Keap1的位點仍被Nrf2占據，新生成的Nrf2由于Keap1的位點飽和而不能被Keap1結合，所以就會以游離狀態源源不斷地進入細胞核而發揮轉錄活性。這就是所謂的“門閂和樞紐”(latch and hinge)學說［8－9］(Fig 2)。

Fig 1［4］ Nrf2 regulatory network

3 Nrf2/ARE通路

ARE是一個特異的DNA-啟動子結合序列，位于超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)等保護性基因的5'端的啟動序列(5-GAGTCACAGTGAGTCGGCAAAATT-3)，這一序列能被多種氧化性和親電性化合物激活，從而啟動II相解毒酶和抗氧化酶基因的表達，保護細胞組織正常功能［10］。Nrf2是這一序列的激活因子。活化的Nrf2從Keap1解離后進入細胞核，在核內與Maf蛋白結合成異二聚體后與ARE序列結合，進而啟動受ARE調控的基因的轉錄。這一表達路徑被稱為Nrf2-ARE通路［11］。有趣的是，Nrf2蛋白作為一種轉錄因子，也可以通過結合其自身基因5＇端的ARE序列，調節其蛋白的轉錄活性［12］。而且，有證據表明，激活的Nrf2-ARE信號通路可以抑制由泛素介導的Nrf2蛋白降解，穩定Nrf2蛋白在細胞質的濃度，增強Nrf2蛋白的轉錄活性［13－14］。這說明Nrf2的激活可以形成一種正反饋調節機制，進一步加強其調節保護性基因的轉錄活性。目前認為Nrf2是調控細胞對抗外來異物和氧化損傷的關鍵轉錄因子。Nrf2缺失或激活障礙，會引起細胞對應激源的敏感性增高。Nrf2-ARE通路在抗腫瘤、抗應激、抗凋亡、抗炎癥反應、抗動脈粥樣硬化以及調節心腦血管反應、神經保護等方面發揮著廣泛的細胞保護功能。

Fig 2［8］ Schematic overview of the Nrf2-Keap1 cytoprotective pathway

4 Nrf2的激活

Nrf2從Keap1解離是Nrf2蛋白激活并發揮轉錄活性的關鍵步驟。Nrf2從Keap1解離有兩種不同的機制:(1)親核物質或ROS直接攻擊作用。親電子物質或ROS對Keap1的半胱氨酸殘基進行修飾，引起Keap1的構象變化，進而導致Nrf2與Keap1解離，Nrf2穩定性增加并轉入細胞核中與ARE結合，這是Nrf2最普遍的活化方式［15］。(2)磷酸化的間接作用。多種蛋白激酶可通過誘導Nrf2的磷酸化參與對Nrf2轉錄活性的調節。目前認為促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)［16］，蛋白激酶 C(PKC)和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)［17］等幾條蛋白激酶途徑參與了Nrf2-ARE激活和依賴其基因表達的調控。

5 Nrf2/ARE通路轉錄調節的抗氧化蛋白

Nrf2-ARE通路之所以重要是因為其激活后能夠啟動下游多種保護性基因的表達。到目前為止，已證實經Nrf2-ARE信號路徑調節的可編碼內源性保護基因超過200個。這些保護性基因包括抗氧化蛋白類基因、Ⅱ相解毒酶基因、分子伴侶類基因和抗炎因子類基因等。它們在增強組織抗氧化能力、保護組織免收毒物損傷、抗腫瘤、抗炎癥、抗凋亡中起著重要的作用［18］。其中，作為Nrf2信號路徑的主要調節蛋白，抗氧化酶類通過催化自由基轉化為無毒物質和增加其水溶性利于自由基排除而發揮作用，是維持機體氧化還原平衡的重要因素［19］。多項研究發現，在Nrf2基因敲除小鼠的基礎及誘導性抗氧化基因表達明顯降低，而氧化應激損傷明顯增強，提示Nrf2-ARE通路是調節細胞內氧化還原狀態的關鍵。現將幾種經Nrf2-ARE通路重要的抗氧化蛋白/酶介紹如下:

5.1 血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1，HO-1)。HO-1是血紅素降解的限速酶，催化血紅素生成等摩爾數的膽紅素、CO和鐵。近年研究發現，HO-1的抗氧化功能一方面與其阻止游離血紅素參與氧化反應有關，另一方面，HO-1及其酶解產物膽紅素、CO共同發揮著抗氧化、抗炎、抑制細胞凋亡和擴血管、改善組織微循環等作用，廣泛參與心、腦、肺、肝、腎等組織細胞的抗氧化應激損傷，是機體最重要的內源性保護體系之一。通過對野生型和Nrf2－/－SD大鼠肝臟缺血/再灌注的研究中發現，肝臟缺血60分鐘后再灌注時，野生型大鼠的肝臟枯否細胞被激活;肝臟、腎臟Nrf2、HO-1蛋白及mRNA水平明顯增高;Nrf2核轉位增加;血清肌酐清除率降低;而在Nrf2－/－大鼠則未出現以上保護作用［20］。李航等研究表明，1%tBHQ添加飼料喂養Ⅰ型糖尿病小鼠可以減輕糖尿病小鼠腎臟的氧化應激損傷，伴隨著Nrf2蛋白的激活和核表達，其調控的抗氧化蛋白HO-1表達明顯增強［21］。另有研究表明七氟烷可以通過激活Nrf2信號通路誘導大鼠海馬神經元HO-1 mRNA表達［22］。以上結果表明，HO-1的表達增強由激活的Nrf2介導的。

5.2 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthethase，γ-GCS)γ-GCS是體內還原型谷胱甘肽(GSH)合成的限速酶，是一個由重鏈亞單位(γ-GCSh)和輕鏈亞單位(γ-GCSl)組成的二聚體。重鏈具有全酶的催化功能，輕鏈無催化活性，但對重鏈的活性起調節作用。增加γ-GCS的含量和活性，可以促進GSH的合成，增強組織細胞抗氧化應激的能力。研究表明ROS和外源性化學有毒物質能夠通過激活Nrf2，上調γ-GCS的表達。喂給Nrf2+/+小鼠吡唑后，其肝臟γ-GCS、HO-1、谷胱甘肽S轉移酶(GST)蛋白表達明顯上調并可降低小鼠肝臟的氧化應激損傷，而Nrf2－/－小鼠無此作用［23］。Okouchi等［24］對高糖培養的人大腦內皮細胞(IHEC)進行研究，發現胰島素可以通過激活PI3K/Akt信號通路促進Nrf2的核轉位，上調γ-GCS蛋白表達，降低髙糖對IHEC的氧化應激損傷。

5.3 超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)研究證實［19］，白藜蘆醇可以降低H2O2刺激引起的大鼠肝臟原代細胞氧化應激損傷，其作用是通過激活Nrf2，進而促進SOD表達介導的。給予Nrf2特異激活劑萊菔硫(500 μg·kg－1·d－1)預處理3 d后，對大鼠心臟進行缺血/再灌注損傷實驗。發現萊菔硫烷治療組心臟左室舒張末壓(LVEDP)、左室形成壓(LVDP)較對照組明顯改善。心肌組織抗氧化蛋白Mn-SOD、HO-1、過氧化氫酶表達明顯升高;而給予特異性抑制劑5-HD預處理3 d則作用相反［25］。此現象說明萊菔硫烷通過激活Nrf2下游的抗氧化蛋白的表達發揮著對大鼠心臟缺血/再灌注損傷的保護作用。

5.4 依賴還原型輔酶/Ⅱ醌氧化還原酶1(NADPH:quinone oxidoreductase，NQO1)NQO1是一種調節細胞內物質處于氧化還原狀態的黃素酶，它以NAD(P)H為受體，催化醌類及其衍生物，使其失去2個電子，發生還原反應，其催化特性在于無單電子還原產物半醌及自由基等氧化產物形成，對各種代謝引起的氧化應激反應具有保護作用。染色體免疫沉淀分析證實Nrf2結合于NQO1基因的ARE序列，并激活NQO1蛋白的表達［26］。以治療劑量的鋅(100 μmol ZnCl2·kg－1·d－1)連續喂養小鼠4 d，可以明顯減輕慶大霉素對大鼠肝功能損害，增加肝臟苯琨還原酶1(NQO1)含量;而增加程度與Nrf2蛋白表達增加呈現正相關［27］。有研究報道［28］，1%tBHQ(W/W)喂養 4 周后，可減輕缺血/再灌注引起的小鼠大腦皮質損傷，增強皮質的NQO 1蛋白表達水平，而此現象在Nrf2－/－小鼠中未出現。

雖然最初對于Nrf2的研究表明，此蛋白非生物體生長發育的必需物質，但是越來越多的研究成果表明Nrf2蛋白在抵抗外來刺激、保護機體功能中發揮著極其重要作用。Nrf2基因敲除的動物組織較正常組織更易受到各種毒性的損害。機體內氧化還原水平失衡是眾多疾病的病理生理基礎，對于機體內源性抗氧化損傷通路Nrf2-ARE的調控，無疑為抗氧化治療提供了新思路。

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