珍珠冰硼散微生物限度檢查方法學驗證

王德啟

（安徽孟仁壽制藥有限公司質檢中心，安徽 宿州234300）

在2005年以前的《中國藥典》版本中未規定對供試品的微生物限度檢驗方法進行驗證，造成在實際檢驗工作中，由于某些藥品成分具有抗菌活性，抑制了藥品中部分微生物的生長，按常規法檢驗得到的結果不準確[1]。為確保微生物限度檢查方法的科學性和檢驗結果的準確性，2005年版《中國藥典》開始規定藥品的微生物限度檢查應進行方法學驗證，以確保藥品微生物限度檢查結果準確可信。珍珠冰硼散是由珍珠、朱砂、冰片、硼砂（煅）、玄明粉等5味藥物組成的散劑，具有去腐、解毒、消炎止痛功效，臨床用于口舌生瘡、齒齦腐爛、腫痛、急慢性咽喉炎等癥[2]。本文就分別采用平皿法、培養基稀釋法、直接接種法[3]對其微生物限度檢查進行了方法學驗證。

1 材料

1.1 樣品

珍珠冰硼散（安徽孟仁壽制藥有限公司，規格：1.5 g/瓶，批號：20070415、20070416、20070417）。

1.2 菌種

大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]（中國藥品生物制品檢所）。

1.3 培養基

膽鹽乳糖增菌液、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基、改良馬丁培養基、改良馬丁瓊脂培養基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基、硫乙醇酸鹽流體培養基（中國藥品生物制品檢定所）。

1.4 稀釋劑

pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（自制）。

2 方法

參照2005年版《中國藥典》（一部）微生物限度檢查法[4]進行試驗。

2.1 菌液制備

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，于30～35℃培養18～24 h；各肉湯培養物分取1m L，加9m L生理鹽水，10倍稀釋至約含50～100 cfu/mL的菌懸液，備用。

接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，于23～28℃培養24～48 h，取經培養好的白色念珠菌真菌斜面培養物，加入生理鹽水4m L，洗下孢子，吸出轉移至無菌試管內，取1m L，加9m L生理鹽水，10倍稀釋至約含50～100 cfu/m L的菌懸液，備用。接種黑曲霉菌斜面的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，于23～28℃培養5～7 d，使大量的孢子成熟。取黑曲霉菌斜面培養物，加入生理鹽水4m L，洗下孢子，吸出，轉移至無菌試管內，取1m L，加9m L生理鹽水，10倍稀釋至約含50～100 cfu/m L的孢子懸液，備用。

2.2 供試液的制備

取供試品10 g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100m L，混勻，作為供試液。

2.3 回收率試驗

2.3.1 平皿法

2.3.1.1 試驗組 取供試液1m L和50～100個/m L試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養24～72 h，逐日觀察結果。每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。

2.3.1.2 菌液組 取上述試驗菌液，測定每一菌株所加的試驗菌菌數。

2.3.1.3 供試液對照組 取供試液1m L加入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養24～72 h，逐日觀察結果，測定供試品本底菌數。

2.3.1.4 稀釋劑對照組 以稀釋劑替代供試液，加入上述試驗菌菌液，置規定溫度下培養24～72 h，逐日觀察結果，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數。

2.3.2 培養基稀釋法

2.3.2.1 試驗組 取供試液分別按0.5m L/皿、0.2m L/皿加入平皿后，加入上述50～100 cfu/m L的試驗菌，立即傾注2005版藥典規定的瓊脂培基，置規定溫度培養24～72 h，逐日觀察結果。

2.3.2.2 菌液組 同平皿法。

2.3.2.3 供試品對照組 除不加菌液外，同試驗組測定方法，置規定溫度培養24～72 h，逐日觀察結果，測定供試品本底菌數。

2.4 結果判斷

在3次獨立的平行試驗中，試驗組的菌回收率均應不低于70%。若試驗組的菌回收率均不低于70%，照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、霉菌和酵母菌數。

2.5 控制菌檢查方法的驗證

2.5.1 直接接種法

2.5.1.1 試驗組 取供試液各10m L，分別加入100m L營養肉湯和膽鹽乳糖（BL）培養基中，加入上述金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌菌液各1m L，按相應的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌檢查法進行檢查。

2.5.1.2 陰性菌對照組 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌檢查，取上述大腸埃希菌菌液各1m L，分別加入100m L BL增菌液和營養肉湯培養基中；大腸埃希菌檢查，取上述金黃色葡萄球菌菌液1m L加入至100m L BL增菌液中，方法同試驗組。

2.5.2 培養基稀釋法

2.5.2.1 試驗組 取供試液10m L加入400m L營養肉湯培養基中，加入上述50～100cfu/m L的金黃色葡萄球菌1m L，置35℃培養24 h，按金黃色葡萄球菌檢查法檢查。

2.5.2.2 陰性菌對照組 取上述大腸埃希菌菌液1m L，加入400m L營養肉湯培養基中，方法同試驗組。

3 結果

結果見表1，表2。

表1 回收率試驗結果

表2 控制菌試驗結果

4 討論

從驗證結果分析，本品具有一定的抑菌性，只是在相同的濃度下對不同細菌的抑制能力不同。從表1可以看出：細菌、霉菌和酵母菌數檢查方法采用平皿法時，對大腸埃希菌的回收率高于70%；采用培養基稀釋法（0.5 m L/皿）時，對黑曲霉的回收率能達到70%；采用培養基稀釋法（0.2 mL/皿）時，對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、桔草芽孢桿菌的回收率均能達到70%。從表2可以看出對控制菌金黃色葡萄球菌的檢查可采用培養基稀釋法，對銅綠假單胞菌、大腸埃希菌的檢查均可采用直接接種法。

驗證結果表明，本品細菌數、霉菌和酵母菌數均可采用培養基稀釋法（0.2 m L/皿）測定，對金黃色葡萄球菌的檢查可采用培養基稀釋法，對銅綠假單胞菌、大腸埃希菌的檢查均可采用直接接種法。

[1] 吳曉玲，李春蓉，陳引秀.清熱解毒藥微生物限度檢查方法學驗證的研究[J].中國藥事，2006，20（8）：496-498.

[2] 國家藥典委員會.衛生部藥品標準（第7冊）[M].北京：人民衛生出版社，1993：111.

[3] 馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊[M].北京：科學出版社，2000：62.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2005年版[M].北京：化學工業出版社，一部附錄：70.