應用rep-PCR分型技術篩選潛在治療性乳桿菌

王江，張瑞芬，周莉，蘇小虎，胡春紅，王萌，向陽，楊毅，朱寶利，馮濤

1 重慶醫科大學基礎醫學院 生物化學與分子生物學教研室，重慶 400016

2 中國科學院微生物研究所，北京 100101

3 惠斯康健康科技 (北京) 有限公司，北京 100086

4 中國科學院大氣物理研究所醫務室，北京 100029

5 衛生部北京醫院檢驗科生化室，北京 100730

6 北京協和醫院婦產科，北京 100005

陰道細菌種類的變化與婦女和胎兒的健康密切相關，陰道的有益菌和條件致病菌在種類和數量上基本恒定，共同維持陰道微生態平衡[1]。其中，乳酸桿菌是維持陰道正常微生態環境最常見和最重要的有益菌[2]，在陰道微生態環境中占到 95%，而主要的乳酸桿菌占到50%~80%[3-4]，它分解陰道粘膜上皮細胞內的糖原產生乳酸和過氧化氫，使陰道保持酸性環境 (pH值為 3.8~4.2)，陰道的酸性環境和過氧化氫對抑制條件致病菌的侵入和生長具有重要的防御作用[3]。

細菌性陰道病是育齡期婦女最為常見但又未受重視的多細菌感染性疾病，以明顯的陰道微生態環境紊亂，乳桿菌優勢地位被大量厭氧菌群替代為主要特征[5]。細菌性陰道病是“小疾病，大麻煩”，患者感染艾滋病和淋病的危險性明顯增加；妊娠婦女易出現妊娠并發癥，如早產及絨毛膜羊膜炎等。由于抗生素治療細菌性陰道病效果欠佳，復發率高達50%以上[6]，因此，調節乳桿菌制劑的研究日益引起人們的重視，國內外一直在努力研制試圖開發一種乳桿菌生態制劑，在利用抗生素清除致病菌后，直接補充陰道內正常生理細菌，調節陰道內菌群平衡。

目前，我國已有乳酸桿菌制劑產品定菌生用于細菌性陰道病的治療[7]，并已經取得了一定的療效，但尚未達到人們預期的效果，這可能與其主要成分德氏乳桿菌并非我國婦女陰道菌群中的優勢菌群有關。近來研究提示：我國健康育齡期婦女陰道菌群的結構相對簡單，以彎曲乳酸桿菌或惰性乳桿菌占優勢[8-9]。不同的彎曲乳酸桿菌分離株可能存在基因型的差異，本研究旨在分離鑒定陰道彎曲乳酸桿菌并通過對其基因分型和產H2O2的初步研究，篩選具有防治女性生殖道感染的彎曲乳酸桿菌菌株。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

細菌基因組 DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，MRS培養基購自美國OXID公司，Taq酶購自 TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成，PCR 擴增儀購自美國 Applied Biosystems公司；電泳儀購自美國BIO-RAD公司，凝膠成像儀購自美國Alpha Innotech公司，培養箱購自上海博遠，酶標儀購自美國BIO-TEK，pH計購自意大利HANNA等。

1.2 菌株

95例健康志愿者陰道分泌物，由衛生部北京醫院檢驗科提供。樣本依次編號為 T1、T2、T3……T95，接種于MRS培養基，37 ℃厭氧培養24 h[10]。每個樣本隨機挑選5個單菌落于2 mL MRS培養基中培養增菌24 h，菌落依次編號T1-1、T1-2、T1-3、T1-4和 T1-5，其余類推。擴增細菌用于細菌保種與DNA制備。

1.3 rep-PCR基因分型篩選

為了避免對所有菌株進行測序，我們首先利用rep-PCR方法對分離所得菌株進行基因分型。擴增引物 REP1R-Dt (3′-CGGNCTACNGCNGCNIII-5′)和REP2-Dt (3′-CATCCGGNCTATCNGCN-5′)[11]。25 μL反應體系：1×buffer，10%二甲基亞砜，上游及下游引物各50 pmol，dNTPs各1.2 mmol/L，MgCl27 mmol/L，2.5 U Taq酶，100 ng DNA模板。反應條件：94 ℃預變性7 min；90 ℃變性30 s，40 ℃退火1 min，65 ℃延伸8 min，共32個循環；65 ℃延伸16 min[12]。PCR產物用1%凝膠電泳進行檢測，成像、比較DNA帶型。選擇具有不同帶型的菌株做下一步的16S rRNA基因序列分析。

1.4 乳酸桿菌的鑒定

采用 27F-1492R通用引物擴增細菌 16S rRNA基因保守區。25 μL擴增體系包括：1×PCR反應緩沖液，200 μmol/L dNTPs，上游及下游引物各0.2 μmol/L，1 U Taq DNA聚合酶，1 μL 乳桿菌基因組DNA。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共25個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%凝膠電泳檢測，陽性結果送北京諾賽公司，用27F-1492R進行雙向測序。將測序結果拼接后選取中間的 1 400 bp與NCBI數據庫比對，與參考序列一致性大于 97%則將其歸為該類乳桿菌。

1.5 H2O2檢測

H2O2標準曲線制作：首先用100 mmol/L 哌嗪-N,N'-二-乙磺酸 (Piperazine-N,N_-Bis 2-ethanesulfonic acid，PIPES) 將30% H2O2(相當于9.128 mol/L) 儲存液稀釋成1 mol/L，再用100 mmol/L PIPES將1 mol/L H2O2分別稀釋成 0、20、40、60、80、100 μmol/L工作液；然后分別取100 μL上述H2O2工作液與100 μL 20 mmol/L TMB (四甲基聯苯胺)、2 μL辣根過氧化物酶 (1 mg/mL) 混合，16 ℃孵育10 min，測量 OD630值。H2O2濃度標準曲線：y=0.0033x?0.0496，R2=0.992。乳桿菌液體培養H2O2濃度檢測：挑取乳桿菌單菌落，接種1 mL培養48 h的菌液于10 mL MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養21 h后，轉換為振蕩培養3 h，振速為220 r/min，然后12 000 r/min離心2 min，取100 μL菌液上清檢測H2O2，根據標準曲線，計算H2O2濃度[13]。

1.6 pH檢測

將活化的乳酸桿菌以5%比例接種MRS培養基(pH 6.3) 中，37 ℃培養。用TECAN infinite M200酶標儀與意大利HANNA精密酸度計每隔12 h測其OD630與 pH值，以 H+濃度與 OD630比值計算單位菌體密度產酸量。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

實驗收集了95例樣品，其中6例培養失敗，剩余89例樣品經過MRS平板培養，挑取445個單克隆進行MRS液體培養及DNA提取；隨后rep-PCR基因分型篩選得到85個具有不同帶型的菌株；再進一步通過16S rRNA測序比對，最后確認65株乳酸桿菌。表1為測序分析結果，其中，L. crispatus 19株，L. jensenii 17株，L. fermentum 12株，主要菌株與文獻報道相符[14]。

2.2 rep-PCR基因分型帶型圖譜比較

人體陰道環境的乳酸桿菌的分布具有復雜性和多樣性，T49號陰道環境中乳酸桿菌種類單一，如圖1所示：隨機挑選的5個乳酸桿菌菌株帶型圖譜一致，說明其中主要含一種乳酸桿菌。與此不同，有的樣本分離的 5個乳酸桿菌菌株圖譜之間存在明顯差異，表現出不同的帶型，如圖2所示，說明T27號陰道環境中可能存在多種不同的乳酸桿菌。不同個體分離到的10株彎曲乳酸桿菌亦存在差異，其帶型存在多樣性，說明彎曲乳桿菌具有多型性，見圖3，其中 T12-1、T29-5和T37-3菌株帶型圖譜相似程度較高，關系較近。

表1 65株乳酸桿菌分布情況Table 1 Distribution of 65 Lactobacillus isolates

2.3 產酸與產H2O2的比較

圖4可見在12 h到24 h這段時間內，隨著培養時間的增加，10株彎曲乳酸桿菌單位菌體密度產酸量增加，變化較快；24 h到36 h時間段體密度產酸量變化不大，基本達到穩定，pH值在4左右。經方差分析，10株彎曲乳酸桿菌單位菌體密度產酸量無顯著差異 (F=2.44＜F0.01=2.59)。從圖5中我們可以看到，彎曲桿菌各亞型間產H2O2能力存在顯著差異(F=7.48＞F0.01=2.59)，其中 T22-3、T29-5菌株產H2O2能力明顯高于其他菌株，T6-1、T12-1、T25-3、T33-1、T35-4、T37-3產 H2O2能力較弱，而 T27-7和T31-3菌株不產H2O2。為此，對于同種乳酸桿菌，我們選擇產H2O2能力，而不是單位菌體密度產酸量作為有益菌篩選指標之一。

圖1 T49樣本乳酸桿菌rep-PCR帶型圖譜Fig. 1 rep-PCR fingerprints of Lactobacillus strains from the sample T49. M: 1 kb plus DNA ladder marker; 1: control; 2: T49-1; 3: T49-2; 4: T49-3; 5: T49-4; 6: T49-5.

圖2 T27樣本乳酸桿菌rep-PCR帶型圖譜Fig. 2 rep-PCR fingerprints of Lactobacillus strains from the sample T27. M: 1 kb plus DNA ladder marker; 1: control; 2: T27-1; 3: T27-2; 4: T27-3; 5: T27-4; 6: T27-5.

圖3 來自不同樣本的彎曲乳酸桿菌rep-PCR帶型圖譜Fig. 3 rep-PCR fingerprints of the 10 L. crispatus isolated from different samples. M: 1 kb plus DNA ladder marker; 1: control; 2: T6-1; 3: T12-1; 4: T22-3; 5: T 25-3; 6: T27-7; 7: T29-5; 8: T31-3; 9: T33-1; 10: T35-4; 11: T37-3.

圖4 10株彎曲乳桿菌產酸能力比較Fig. 4 Acid production of the isolated 10 L. crispatus.

圖5 10株彎曲乳桿菌產H2O2比較Fig. 5 Hydrogen peroxide production of the 10 L. crispatus.

3 討論

乳桿菌作為一種益生菌已廣泛應用于胃腸道疾病的治療，Lactobacillus casei rhamnosus乳桿菌通過 Lactocin 160抑制致病菌的生長、調節胃腸道菌群平衡起到預防腹瀉、治療便秘的作用[15]。近年來，在 BV治療方面也有較多相關報道，如德氏乳桿菌 DM8909菌株 (商品名定菌生) 已在臨床上用于BV的治療。單一菌株治療BV具有一定的局限性，研究者們還應用多種乳桿菌聯合治療BV，將具有較強定植力的Lactobacillus brevis (CD2) 乳桿菌與能產抗菌物質的 Lactobacillus salivarius (FV2)乳桿菌和 Lactobacillus plantarum (FV9) 乳桿菌制備成混合菌劑，取得了較好的治療效果[4]。然而，大多數菌劑的治愈率僅能達到60%~70%[7]，仍有必要繼續尋找適合我國人群的用于防治 BV的乳桿菌菌株。

本實驗首次采用了 rep-PCR技術，對健康婦女陰道內彎曲乳桿菌種進行了初步的基因分型。rep-PCR技術是一種分析細菌基因指紋圖譜的新方法，它是通過PCR擴增細菌基因的重復DNA 片段來獲得菌株特異性圖譜。目前，有兩種主要的重復序列片段用于該方法中，一種是基因外重復回文序列(Repetitive extragenic palindromic elements，REP)，一種是基因間重復序列 (Enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC)，本實驗采用的是基因外重復序列，它是1個長為38 bp的DNA片段，由1個保守回文段及兩端分別有6個簡并位點和1個5 bp的可變框組成[16]。rep-PCR技術具有高分辨力、高通量性、重復性好、費用低等特征，是一種可靠的基因分型方法[17]。經rep-PCR技術我們發現正常陰道乳桿菌在不同個體的分布具有多樣性，有的婦女僅含有一種乳酸桿菌，而有的婦女具有多種乳酸桿菌；另外，彎曲乳酸桿菌種間存在多樣性，健康婦女不同個體中的彎曲乳桿菌分離株存在不同基因型，10株彎曲乳桿菌樣本帶形圖譜不相同，我們可以推測個體抵抗致病菌侵襲以及包容外源益生菌能力的強弱可能與乳酸桿菌種類的多樣性相關。這也能解釋單一菌株的乳桿菌治療BV療效不一。

有報道乳桿菌產酸、H2O2能力與其抑菌能力成正相關[18]。乳桿菌通過產乳酸或其他脂肪酸來維持陰道酸性環境[19-20]。H2O2通過介導細菌 DNA的破壞，來抑制其他細菌的生長[21]。因此，生態菌劑的開發，還必須兼顧乳桿菌產酸、產H2O2能力等一些與治療作用機理相關的理化特性。本研究表明，產H2O2能力在彎曲乳桿菌不同型別存在較大差別，而同種乳桿菌產酸能力差別不大。

總之，健康婦女陰道內存在多種乳桿菌，且具有個體差異性，彎曲乳酸桿菌各型間產酸能力相差不大，而產H2O2能力差異明顯。彎曲乳桿菌的多樣性也為制備新型的益生菌劑提供了豐富的資源，為找到一種適用范圍廣的乳桿菌成為可能，我們可利用不同種、型間的優勢并結合其產酸、產 H2O2能力開發出一種含不同乳桿菌的混合菌劑來治療BV。選擇乳桿菌益生菌治療 BV時，需要綜合考慮陰道內乳桿菌的分布多樣性，及其產酸、產H2O2能力，另外，還需要強調一點：乳桿菌與陰道上皮細胞粘附的能力與其能否在陰道成功定植有關，是乳桿菌持續作用的基礎，也是乳桿菌治療 BV療效的關鍵因素[22]。

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