重組腺相關病毒載體相關性雜質

刁勇，王啟釗，肖衛東，許瑞安

華僑大學分子藥物學研究所 分子藥物教育部工程研究中心，泉州 362021

長期以來研究人員一致認為重組腺相關病毒(rAAV) 載體具有無致病性、低免疫原性等優點，前期涉及嚙齒類及靈長類動物的大量臨床前研究也從未發現其會引起嚴重不良反應[1]，但由美國賓州大學主持進行的治療血友病的rAAV基因藥物I/II期臨床研究卻發生了嚴重的細胞免疫反應[2]，患者轉氨酶水平急劇升高，肝功能受到嚴重損害，臨床研究被迫終止。究其原因，載體衣殼蛋白 (Cap) 是引起該細胞免疫毒性的主要元兇[3-4]，載體中可以表達Cap的類AAV病毒以及空病毒顆粒等載體相關性雜質均可能是抗原的供應源[1]。rAAV載體相關性雜質是指與其本身性質非常類似的雜質，主要包括以下3類：包裹有載體基因組之外的核酸序列的類AAV病毒顆粒；空病毒顆粒；rAAV多聚體。rAAV載體相關性雜質的產生與載體的生產方法密切相關，因該類雜質的理化性質與載體本身非常類似，通過常規純化方法難以去除 (如空病毒顆粒和多聚體)，甚至幾乎不可能去除 (如包裹殘留質粒或宿主細胞DNA的類AAV病毒顆粒)。如果該類雜質大量出現在臨床應用的制劑中則可能產生難以預料的不良后果：如類AAV病毒顆粒中包裝的抗生素抗性序列可能會引起病人對抗生素的耐藥性，AAV復制基因rep則具有潛在的致突變風險，rAAV多聚體的形成則會嚴重降低產品的穩定性，增加衣殼抗原的免疫原性。如何減少rAAV載體相關雜質的污染，防止rAAV載體相關雜質的形成，是當前建立 rAAV載體生產工藝最重要的任務之一。

1 類AAV病毒顆粒

在生產 rAAV載體的過程中，轉染用質粒或宿主細胞DNA會被誤包裝而形成類AAV病毒顆粒。類AAV病毒顆粒又可分為可復制型 (rcAAV) 和復制缺陷型兩類。曾有報道在 17批不同血清型的rAAV產品中，可表達cap基因的rcAAV污染率可達0.4%~1.0%，如采用非優化工藝進行生產污染率則可高達 10%[5]。體內應用 rAAV載體后可在多種組織內檢出污染的雜質DNA序列，部分DNA序列與 AAV的反向末端重復 (ITR) 相連接存在，并在一定條件下可以釋出并具有復制活性[6]。近期動物實驗表明，cap基因在體內的表達會引起嚴重的免疫反應[7-8]，而包裝有其他DNA雜質的rcAAV則具有致瘤性或引入抗生素抗性的潛在風險[6]。

因類AAV病毒顆粒與真正的AAV病毒幾乎完全一樣，一旦形成則難以去除，必須從包裝工藝入手防止或減少其產生。AAV基因組含有兩個開放閱讀框架，分別編碼調節基因 (rep) 和結構基因(cap)，兩端為145 bp的ITR。ITR是病毒復制和包裝必須的順式作用元件。三質粒共轉染法是生產rAAV載體最常用的方法，所用的 3個質粒分別為rAAV載體質粒 (p-vecter)、AAV輔助質粒 (p-AAV)和Ad病毒輔助質粒 (p-Ad)。在 p-vecter內，AAV基因組的rep–cap基因被轉基因表達框所替代。Rep和Cap蛋白由p-AAV反式提供。p-Ad則替代了最初研究所應用的腺病毒，負責提供包裝 rAAV所必須的輔助病毒的相應功能。

類AAV病毒顆粒的形成主要是由于rAAV載體質粒和輔助質粒間的非同源重組而引起，載體質粒中含有的ITR在重組事件中發揮了重要作用[6]。ITR是AAV復制、包裝所必需的最少自身序列，序列中CG 含量達80%以上，其前125 bp (1~125) 序列依次可分為A、B、B’、C’、C和A’等不同的區段，其中A與A’、B與B’、C與C’反向互補可形成T形發夾結構，作為AAV基因組自我復制的起點。ITR末端20 bp大小的D序列是唯一的非回文序列，具有 Rep蛋白結合位點 (RBS) 和末端解鏈位點(TRS)，對AAV的復制和包裝非常重要，TRS和包裝信號均處于D序列中。基因組中含有一個ITR及兩個D序列即可以滿足AAV基因組的復制和包裝需要。在缺失D序列時，ITR形成的發夾結構不足以包裝基因組。Wang等將載體質粒中ITR的D序列遠端的10個核苷酸缺失后，發現可以抑制載體質粒和輔助質粒之間的非同源重組，產品中rcAAV的含量因此大大降低[9]。

Nony等[10]發現位于rep基因5′端的順式復制元件 (CARE) 具有Rep依賴性復制活性，在無ITR序列存在的條件下，輔助質粒中的rep-cap基因也可以被包裝形成復制缺陷型類AAV病毒顆粒。將CARE缺失后，則未檢出包裝有rep-cap基因的類AAV病毒顆粒。質粒的復制能力對其被包裝的可能性也有很大影響[6]。與含有 ITR的載體質粒比較，幾乎缺失了p5啟動子全部序列的輔助質粒pDG被包裝的幾率要小。Allen等以異源性啟動子替代輔助質粒中使用的p5和p40啟動子；將rep和cap基因分為兩個獨立的轉錄單元，且轉錄方向相反，有效地降低了rep和cap基因被重組包裝為rcAAV的可能性[11]。

AAV對基因組的大小有嚴格限制，如超過4.7 kb就很難包裝為病毒顆粒。本課題組在輔助質粒的rep和cap表達框內插入某些特定的內含子，使得輔助質粒基因組的大小遠遠超出了 AAV的包裝容量而不被誤包裝，rcAAV的污染可以降低2~3個數量級[12]。Hauck等使用類似的策略，也成功地降低了rAAV2和rAAV6載體中類病毒顆粒的污染[13]。

基于ITR在野生型AAV生長過程中發揮的重要作用，我們將包裝缺陷型ITR引入輔助質粒，希望輔助質粒如同野生型AAV一樣對rep和cap基因的表達發揮順式時空調控作用，從而提高 rAAV的生產效率[14]。在輔助質粒內插入一定的異源性內含子，使其體積大大超過 AAV的包裝容量而不被包裝為類AAV病毒顆粒；另外因所用的ITR缺失了D序列中的包裝調控序列，有利于減少rcAAV的產生。結果該方法既將rAAV的包裝效率提高了20倍，又有效地降低了rcAAV的產生。

2 空病毒顆粒

AAV空病毒顆粒是不含任何DNA的假病毒，僅由3種不同的衣殼蛋白VP1、VP2和VP3 組成，構成定量比與真AAV一樣為1∶1∶10。空病毒顆粒的自組裝與載體 DNA的復制和包裝無關。在 Rep蛋白的參與下，組裝好的空病毒顆粒向核質遷移，載體 DNA的包裝發生在已組裝完畢的空病毒顆粒遷移至核質后。野生型AAV的包裝效率雖然明顯高于 rAAV，但也會產生 50%以上的空病毒顆粒，而制備rAAV載體時應用的rep基因序列往往缺失了部分順式元件 (如p5啟動子和CARE元件)，所以包裝效率顯著降低，空殼率更高。由于 rAAV載體衣殼與AAV空病毒顆粒的構成完全一致，采用實驗室常規的親和層析方法根本不能將二者有效分離。

大量探討 rAAV載體引起嚴重的肝細胞免疫毒性原因的后續研究表明，該細胞免疫反應由 rAAV載體衣殼蛋白所引起，載體衣殼蛋白抗原通過經典或非經典抗原遞呈途徑被遞呈至病人肝細胞表面，然后激活記憶性T細胞引起免疫反應[3]。rAAV載體的細胞免疫反應與抗原輸入量呈量效關系。空病毒顆粒內不含轉基因組，不僅沒有任何療效，反而會增加抗原輸入量[1,15]。另外，空病毒顆粒的存在還會降低 rAAV載體的溶解度，促進其凝聚，影響其儲存穩定性[16]。

通過分析比較空病毒顆粒與 rAAV載體性質的差異，可以對常用 rAAV載體生產工藝進行優化，建立有效減少終產品中空病毒顆粒含量的純化方法，從而提高藥物比活性，降低臨床用藥劑量，降低病人體內衣殼蛋白抗原負荷，提高產品穩定性。

基于空病毒顆粒與rAAV載體浮力密度的差異，可以通過密度梯度離心法進行分離。在氯化銫(CsCl) 密度梯度離心后，野生型 AAV出現在密度1.41 g/mL處，rAAV載體因為轉基因表達框大小不同而稍有差異。空病毒顆粒因不含基因組而出現在較低的密度區間 (約 1.32 g/mL)，可以很容易與rAAV載體分離，成為CsCl密度梯度離心最突出的優點。但由于rAAV載體與核酸及蛋白雜質間存在非特異性結合，三者的數量比也不均衡，往往需要2次、甚至3次CsCl梯度離心才得到高純度rAAV載體。但rAAV載體長時間與高濃度CsCl接觸，會導致滴度降低。Auricchio首先詳細研究了 CsCl對 rAAV載體的破壞作用，他們將 rAAV載體與CsCl孵育24 h后，rAAV載體感染滴度降低2倍[17]。在72 h后，相當于2次CsCl梯度離心，rAAV載體感染滴度僅存13%。碘克沙醇是一種長期臨床應用的X線造影劑，可以替代CsCl有效去除空病毒

顆粒[18-19]。

密度梯度離心的優點是適用于所有血清型rAAV的純化。缺點主要是僅經密度梯度離心得到的產品，純度尚達不到臨床應用標準，另外處理量小、不易放大生產規模也限制了其應用。最近研究認為，適當增加前處理，可以縮小樣品體積，有利于密度梯度離心方法的工業化應用。Ayuso等[20]在CsCl梯度離心工藝前，增加PEG沉淀步驟，產品的純度明顯提高，雖然也需要2次CsCl梯度離心，但體內外效價無明顯降低。Lock等[19]則常用切向流過濾(TFF) 技術，對密度梯度離心前樣品進行濃縮。他們用截留分子量為 100 kDa的 TFF膜將樣品濃縮130倍，為之后的密度梯度離心提供了方便。濃縮樣品經碘克沙醇密度梯度離心得到的 rAAV8、rAAV9載體產品中，空白病毒顆粒含量為0.4%~5%，回收率為26%左右[19]。

空病毒顆粒包裝載體基因組后其構型可能發生改變，導致衣殼蛋白VP1和VP2的N-端酸性氨基酸殘基從病毒顆粒五重對稱軸的孔中穿出；載體基因組的包裝導致病毒整體陰離子電荷增加，兩種因素均導致 rAAV載體的等電點較空病毒顆粒有所降低[21]。因此可以通過離子交換色譜法將空病毒顆粒與載體分離[21-22]。

Urabe等[23]采用陰離子交換色譜成功地將空病毒顆粒與 rAAV1載體分離。以反離液離子(Antichaotropic ion)，如 NH4+、(CH3)4N+、PO43?和SO42?等代替 NaCl進行鹽濃度梯度洗脫，分離效果明顯增加，特別是 [(CH3)4N]2SO4和硫酸三甲基胺最佳。上樣溶液的 pH對分離效果也有顯著影響，高pH值9和8.5的效果優于8.0和7.5。經過1次高分辨柱陰離子交換色譜分離后，大約90%的空病毒顆粒被去除。第2次高分辨柱純化后得到的rAAV1載體樣品中空病毒顆粒含量少于 5%，回收率均高于50%。純化后樣品生物滴度顯著增加，小鼠肌肉注射rAAV1載體后第56天，血清轉基因表達較未去除空病毒顆粒的樣品增加10倍左右[23]。Qu等[21]采用陽離子和陰離子交換二步色譜法，得到的終產品中空病毒顆粒含量小于1%，總體收率為74%。該工藝不僅適用于血清型 rAAV2載體，也可以用于rAAV6載體的純化。

膜色譜是將液相色譜與膜分離融合于一起的新型生化分離技術，具有選擇性高、分離速度快、能耗低、易放大等特點，是分離純化生化大分子藥物的有力工具。與液相色譜比較，膜色譜擴散路徑短、傳質快、分離時間短、分離效率顯著提高、易于放大、便于實現大規模連續分離和自動操作。與膜技術相比，膜色譜不僅是利用膜孔徑的大小，更主要的是利用其特異性和選擇性，只要選擇合適的膜就可以從復雜體系，尤其是細胞培養液中分離和制取出任何一種生物大分子。近年來該技術被用于rAAV載體的純化，可有效去除空病毒顆粒雜質[22]。將rAAV載體收獲液上樣至陽離子交換膜后，空病毒顆粒因等電點高呈現較強的正電性，絕大部分 (97%)被吸附至陽離子交換膜，而 rAAV載體則直接穿透通過。然后將穿透液上樣至陰離子交換膜，經NaCl濃度線性洗脫后，空病毒顆粒含量降低至1%以下。

3 rAAV多聚體

在 rAAV載體的純化和儲存過程中，如實驗條件選擇不當，往往會促使 rAAV載體聚集形成多聚體，從而影響純化收率，降低產品的穩定性。

AAV在常用緩沖液 (如磷酸鹽緩沖液和Tris緩沖液) 中的溶解度較低，當濃度達到2×1013VP/mL時，就會出現一定程度的聚集現象。濃度為25%的甘油溶液可以增加其溶解度至1.8×1015VP/mL[24]，但甘油含量如低于 5%則無明顯作用。中性表面活性劑辛基-吡喃葡萄糖苷 (0.01%~0.5%) 可緩解AAV的聚集，降低溶液pH則有利于提高溶解度。在加入 0.5%辛基-吡喃葡萄糖苷的條件下，濃度為2×1013VP/mL的樣品在pH 4.5時完全溶解，升高至5.7則出現聚集[24]。

一般認為溶液中二價陽離子較一價陽離子能更好地抑制病毒的聚集[24-25]，但Wright等[26]的研究表明，rAAV載體溶液的離子強度是影響其聚集的重要因素，無論采用的離子種類如何，只要增加離子強度至 200 mmol/L就可以抑制 rAAV的聚集。Wright等[26]曾推測rAAV的聚集可能是由于相鄰病毒粒子間帶電氨基酸殘基的相互作用引起，所以嘗試以游離支鏈氨基酸阻止聚集的發生。但氨基酸的加入對 rAAV的聚集并沒有特殊的作用，仍然需要達到200 mmol/L的離子強度才有效果。

凍融循環是 rAAV載體制備工藝中裂解細胞常用的手段，也是引起病毒聚集的因素之一。在150 mmol/L的磷酸鈉緩沖液中rAAV在4 ℃保存5 d未見聚集，但一次凍融 (4 ℃~?20 ℃) 就導致明顯的聚集[26]。在10 mmol/L磷酸鈉緩沖液 (pH 7.4) 保存的rAAV經過4 ℃至?80 ℃的一次凍融循環，滴度降低3倍以上[27]。

在 rAAV載體生產工藝中，雖然都含有降解核酸的步驟，但裂解液的鹽離子種類和濃度并不是核酶 (一般為Benzonase) 的最佳反應條件，所以rAAV載體表面仍殘留痕量核酸雜質。對純化后樣品再次進行核酶處理后，即使在低離子強度條件也未見聚集現象，而未處理的樣品則需要高離子強度 (大于200 mmol/L) 才能抑制聚集現象[26]。這說明載體表面的核酸雜質可以通過離子鍵與相鄰病毒粒子結合形成多聚體。細胞裂解液中一價陽離子的存在會降低核酶的活性，造成DNA降解不充分，以二價陽離子 (如 Mg2+) 鹽代替鈉鹽則有利于提高核酶處理的效果，核酶處理30 min后再調節離子強度至0.15 mol/L，rAAV的收率提高4倍[25]。Qu等[21]在用離子交換色譜去除空病毒顆粒的工藝中，在陽離子交換色譜柱上進行原位核酶消化處理，結果既有效地避免了 rAAV載體的聚集，又提高了與空病毒顆粒的分離度。

4 結論

安全、穩定、有效是對所有藥品最基本的三大要求，基因治療藥物更需要把安全性指標放在首位。雖然近年來應用rAAV載體在治療Leber’s先天性黑內障方面取得重大突破[28-29]，因此被Science雜志評為2009年十大科學進展之一[30]，但rAAV載體在臨床研究中出現的細胞免疫毒性[2]，時刻提醒人們必須對其安全性給予高度關注。

rcAAV是類AAV病毒顆粒中危害最大的載體相關性雜質，一旦轉染人體細胞便可以源源不斷地產生異源蛋白，造成意想不到的不良反應。因這類雜質與 rAAV載體的性質如出一轍，目前尚無下游純化技術可以去除，必須從上游工藝技術著手加以限制，如對生產用各種質粒的表達元件進行優化，防止同源或非同源重組，防止非載體基因組的病毒包裝。因痕量rcAAV即可造成大危害，本課題組將特異性 microRNA結合序列引入 rAAV輔助質粒rep-cap基因的3′ UTR區域，以便在即使存在rcAAV污染的情況下，也可以控制rcAAV在靶細胞內的異源蛋白表達[31]。

空病毒顆粒是在 rAAV載體包裝前產生，但可以通過下游技術去除的一類雜質。雖然其與 rAAV載體外殼一致，但二者浮力密度的差異足以采用密度梯度離心加以分離。近期開發的離子交換色譜方法更為規模化生產提供了技術手段。然而，二者理化性質的近似性仍然對分離條件的參數控制提出了嚴格要求。

rAAV多聚體是在下游處理及儲存過程中出現的一類雜質，離子強度、pH、溫度等實驗參數的非優化選擇均可能導致 rAAV載體的聚集，而這些參數的優化和控制也正是在實際操作中容易被忽視或難以持續被關注的常見問題。

隨著 rAAV載體本身的不斷更新和優化[32]、細胞包裝技術的不斷成熟[33]，下游生產純化技術的同步發展也一定會極大地促進其在臨床上更廣泛地應用，加速其產業化進程。

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