一種含精-甘-天冬氨酰三肽人纖溶酶原K區缺失突變體在巴斯德畢赤酵母中的表達、純化與特性

陳武，吳茂材，吳敬源，楊健忠，陳振林，黃智慧，張鑫涌，肖鄖

1 廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，廣州 510006 2 湖北醫藥學院附屬十堰人民醫院，十堰 442000

栓塞是導致心腦血管疾病死亡的重要原因之一，溶栓治療是一種有效的手段。目前臨床使用的主要溶栓藥物，如組織纖溶酶原激活劑 (Tissue-type plasminogen activator，t-PA)、尿激酶 (Urokinase-type plasminogen activator，UK)、鏈激酶 (Streptokinase，SK)，盡管表現出一定的治療效果，但由于需激活血液內的纖溶酶原 (PLG) 為纖溶酶 (PLM) 后方能發揮溶栓作用，因此對陳舊性血栓的效率較低，導致治療窗短、出血并發癥較高，且不能阻止溶栓后再栓。近年來研究表明：由于PLM是血液內發揮纖溶及栓溶作用的主要蛋白酶，與t-PA、UK、SK相比，PLM具有無免疫原性、可直接溶栓、出血并發癥低等特點[1-2]。但由于PLM的K區富含糖鏈、結構復雜，且易自身降解，近年來通過大腸桿菌、哺乳動物細胞表達均未獲得高水平的活性蛋白[3-4]。

一些學者通過構建小分子突變體，提高了表達水平，且保留了較好的纖溶活性，其中部分進入臨床實驗研究[5-6]。我們前期工作構建了人纖溶酶原K區缺失突變體 (hPLG-?K)，顯示出與 PLM相近的纖溶活性[7]。本研究在此基礎上，通過突變激活環上的Pro559為Asp559，從而構建出含有Arg-Gly-Asp (RGD) 三肽結構的突變體 RGD-hPLG-?K，并通過酵母表達后，以期獲得一種具有直接溶栓作用和抗栓作用的重組人PLG。RGD序列可與纖維蛋白原競爭結合與血小板聚集相關的膜受體GPIIb/IIIa，阻斷血栓形成的最后共同通路，其模擬物臨床上常用于預防再栓塞[8]。目前已構建了多種包含RGD的融合蛋白，且顯示出較好的抗栓功能[9-10]。……