噬菌體展示HIV-1 Tat38-61堿性區51和55位隨機突變體文庫的構建

葛宜兵，楊旭芳，杜哲明，龐強，曹潔，陳秋莉，王錦紅，張華群，廖文婷，祁培培，劉超，章萍萍，鄧松華，潘衛

1 安徽醫科大學 病理生理學教研室，合肥 230032

2 中國人民解放軍第二軍醫大學 微生物學教研室，上海 200433

3 武警江西總隊醫院外一科，南昌 330000

目前，艾滋病 (Human immunodeficiency virus，HIV) 已經成為我國乃至全球所面臨的重大公共衛生問題，研制有效的HIV疫苗是HIV防治的重要手段之一。人免疫缺陷病毒Ⅰ型 (Human immunodeficiency virus-1，HIV-1) 的反式激活蛋白Tat (Trans-activator of transcription) 是HIV復制早期產生的一種重要調控蛋白，在 HIV-1的復制、擴散和致病中起重要作用[1-3]。Tat還可被感染細胞通過多種方式分泌到胞外發揮“病毒毒素”的作用：通過誘導CD4+T細胞、NK細胞和B細胞的凋亡，發揮其免疫抑制的作用[4-6]。HIV-1 Tat分子含有N端區 (1~21aa)、半胱氨酸富集區 (22~37aa)、核心區 (38~48aa)、堿性氨基酸富集區 (49~59aa)、谷氨酰胺富集區(60~72aa) 以及C端區 (73~101aa) 6個功能區[7]。

堿性氨基酸富集區 (49~59aa) 與 HIV RNA的轉錄激活反應單元 (Transactivation response element，TAR) 結合，促進病毒基因組的轉錄，激活病毒復制[8]。該區域含有核定位序列 (Nuclear localization signal，NLS)，具有核轉位功能，此外，該區具有穿膜功能，是 Tat進入旁觀者細胞和穿越血腦屏障的結構基礎[9-10]，在卡波氏肉瘤[11]和艾滋病腦病[12]的發生中起重要作用。該序列在各亞型間高度保守，是序列中最保守的區域，同時堿性區還是Tat的主要中和表位之一，其抗體可完全消除Tat分子所特有的穿入其他細胞內發揮毒性作用的核心功能[13]。目前，重組表達的具有生物學活性的全長Tat蛋白作為治療性疫苗已進入臨床II期[14-15]。鑒于Tat分子的毒性作用，消除Tat生物學活性并保留其免疫原性是新型Tat疫苗研發的重要方向。通過對堿性區進行突變消除其生物學活性是很好的選擇，有研究表明將 Tat全長 27、51、55、79位分別定點突變為絲氨酸 (S)、蘇氨酸 (T)、亮氨酸 (L) 和丙氨酸 (A) 后，其生物學活性被大大減弱且免疫原性未受影響，但 51、55位的單獨突變體生物學活性減弱不明顯[16]。Tat 51、55位位于堿性區表位內，并且其序列高度保守，幾乎不發生變異，如此保守的位點發生變異到底能否影響及如何影響其生物學活性及免疫原性尚未有系統的研究，為了回答這一問題，本研究對Tat(38-61) 51、55位分別進行隨機突變，構建噬菌體展示 HIV-1 Tat38-61(51N/55N) 堿性區突變體庫，為應用分子進化的方法系統研究 51、55位突變對抗原性的影響，并以此為獲得可用作疫苗候選物的新型Tat突變體奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒

經大腸桿菌偏愛密碼子優化的編碼天然 HIV-1 HXB2株Tat蛋白的重組質粒pET32a-Tat(1-101)、大腸桿菌E. coli TG1、質粒pCANTAB5S、輔助噬菌體M13K07均由第二軍醫大學微生物教研室構建保存[17]。

1.1.2 試劑

限制性內切酶 XbaⅠ購自華美生物公司；高效連接液購自TOYOBO公司；堿性磷酸酶 (CIP)、DNA marker購自寶生物工程 (上海) 公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自TIANGEN BIOTECH (北京)公司；質粒抽提試劑盒及DNA Taq酶購自上海申能博彩生物公司。

1.1.3 引物序列

用于擴增制備K51位、R55位隨機突變片段的引物共 6條，見表 1。用于噬菌粒展示載體pCANTAB5S中克隆片段的 PCR擴增及測序引物為：pCANTAB5S-1：5′-CAACGTGAAAAAATTATT ATTCGC-3′ (上游引物)；pCANTAB5S-6：5′-GTAAA TGAATTTTCTGTATGAGC-3′ (下游引物)。以上引物均委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 K51位、R55位隨機突變片段的擴增制備、酶切及純化

以pET32a-Tat質粒為模板，以Up-1、51D為引物，擴增51位和55位隨機突變的 Tat1-61(51N/55N)，PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 40 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。以pET32a-Tat質粒為模板，以56U、Down-1為引物，擴增 Tat56-101，PCR反應條件同上。再以 Tat1-61 (51N/55N)、Tat56-101片段的PCR混合產物為模板，以Up-1、Down-1為引物，Overlap PCR擴增51位和55位隨機突變的Tat1-101(51N/55N)，PCR反應條件同上。最后以Tat1-101(51N/55N) 片段的PCR產物為模板，以 38U、61D為引物，擴增51位和 55位隨機突變的Tat38-61(51N/55N)，PCR反應條件同上。取Tat38-61(51N/55N) PCR產物，用XbaⅠ酶切，酶切產物經2%瓊脂糖電泳，膠回收純化。

1.2.2 噬菌粒pCANTAB5S的制備、酶切及去磷酸化處理

取pCANTAB5S TG1菌種接種于3 mL 2×YT (Amp) 培養基中，37 ℃、250 r/min振蕩培養過夜。提取質粒后用 XbaⅠ酶切，回收酶切后的pCANTAB5S載體，用2%瓊脂糖電泳定量。將回收后的酶切載體pCANTAB5S用CIP去磷酸化，回收經過去磷酸化處理的pCANTAB5S載體，用2%瓊脂糖電泳定量。

1.2.3 Tat38-61(51N/55N) 突變體重組噬菌體展示原代文庫的構建

取20 μL (4 μg) Tat38-61(51N/55N) 酶切片段與10 μL (2 μg) 經去磷酸化處理的pCANTAB5S混勻，加入15 μL 高效連接液按說明書進行連接反應。連接產物轉化E. coli TG1感受態細胞，加入500 μL 1.3×1012TU/mL的M13K07輔助噬菌體拯救，制備原代 Tat38-61(51N/55N) 突變體隨機組合噬菌體展示文庫。另取10 μL、1 μL、0.1 μL菌液涂LB (含Amp 100 ng/mL) 平皿計轉化數測定庫容。整個噬菌體展示文庫的構建流程見圖1。

表1 Tat38-61(51N/55N) 隨機突變引物Table 1 Tat38-61(51N/55N) primers for random mutagenesis

1.2.4 噬菌體文庫滴度測定及無菌試驗

取1 μL噬菌體文庫作10倍系列稀釋，各取10 μL噬菌體文庫感染對數生長期的E. coli TG1 100 μL，37 ℃、250 r/min振蕩培養1 h后，涂布LB (含100 ng/mL Amp) 平板，37 ℃培養過夜。計數不同稀釋度的平皿上生長的菌落數，菌落數乘以稀釋度再乘以 100即為每毫升噬菌體的轉化單位數(Transformation unit，TU)，即滴度。

無菌試驗：取10 μL噬菌體濾液涂布LB平板，37 ℃培養過夜，觀察有無菌落生長。

1.2.5 Tat38-61(51N/55N) 突變體庫的PCR鑒定及序列分析

分別從轉化平皿上挑 23個單克隆加入 SOB (Amp) 液體培養基中，37 ℃、250 r/min振蕩培養5 h后，以菌液為模板，pCANTAB5S-1、pCANTAB5S-6為上下游引物進行PCR擴增，PCR反應條件同上。1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，通過電泳圖與陽性對照及DL2000 DNA marker比較判斷文庫中單克隆插入片段的大小和分布情況。

挑取PCR鑒定插入陽性單克隆33個，委托北京六合華大基因科技股份有限公司進行序列測定，測序引物為pCANTAB5S克隆位點PCR鑒定引物pCANTAB5S-1和 pCANTAB5S-6，測序結果用DNASTAR軟件分析，根據測序結果分析 Tat38-61中51、55位氨基酸突變的隨機性。

圖1 Tat38-61(51N/55N) 隨機突變文庫的構建Fig. 1 Construction of Tat38-61(51N/55N) random mutation library.

2 結果

2.1 隨機突變體片段的擴增、制備與酶切

以pET32a-Tat質粒為模板，分別以Up-1、51D及56U、Down-1為引物，擴增Tat1-61(51N/55N) 及Tat56-101，大小分別為183 bp和138 bp，與理論值相符；再以 Tat1-61(51N/55N)、Tat56-101片段的PCR混合產物為模板，以Up-1、Down-1為引物，Overlap PCR擴增 Tat1-101(51N/55N)，大小為303 bp，與理論值相符；最后以Tat1-101(51N/55N)片段的PCR產物為模板，以38U、61D為引物，擴增Tat38-61(51N/55N)，大小為138 bp，與理論值相符。Tat38-61(51N/55N) 片段回收后經XbaⅠ酶切，得到酶切后大小為96 bp的Tat38-61(51N/55N) 片段 (圖2)。

2.2 噬菌粒pCANTAB5S的酶切及去磷酸化處理

噬菌粒pCANTAB5S經XbaⅠ酶切，試劑盒回收純化，大小為4 555 bp，與理論值相符，與未酶切前的構象區別明顯。經 CIP處理后的噬菌粒pCANTAB5S與酶切構象保持一致 (圖3)。

圖2 Tat38-61(51N/55N) 突變體片段的PCR擴增 (A) 及酶切鑒定 (B)Fig. 2 PCR amplification of fragment Tat38-61(51N/55N) (A) and restriction digestion analysis (B). (A) M: DL2000 DNA marker; 1: PCR product of Tat1-61(51N/55N); 2: PCR product of Tat56-101; 3: PCR product of Tat1-101(51N/55N) (303 bp); 4: PCR product of Tat 38-61(51N/55N). (B) M: DL2000 DNA marker; 1: PCR product of Tat38-61(51N/55N) digested with Xba I; 2: PCR product of Tat38-61(51N/55N) without digestion.

2.3 噬菌體展示 Tat38-61(51N/55N) 隨機突變文庫的構建

XbaⅠ酶切后的 Tat38-61(51N/55N) 片段與經CIP處理的噬菌粒 pCANTAB5S連接，連接產物轉化E. coli TG1，輔助噬菌體M13K07拯救，得到Tat38-61(51N/55N) 隨機組合噬菌體展示文庫。該庫的庫容量即轉化數為5.0×106CFU，滴度為2.65× 1012TU/mL，無菌試驗為0。

2.4 噬菌體展示 Tat38-61(51N/55N) 隨機組合文庫插入片段的檢測情況

PCR檢測組合文庫的插入片段情況見圖 4，可見不同插入片段在文庫中的分布比例如下：在23個單克隆中，插入0個Domain的即5S載體自連為10個，百分比為46.5%；1個Domain的為11個，占47.8%；2個Domain及以上的為2個，占8.7%；陽性克隆比例總計達56.5%。

2.5 隨機點突變組合文庫重組子測序結果

圖3 噬菌粒pCANTAB5S酶切和去磷酸化鑒定Fig. 3 Digestion and dephosphorylation identification of pCANTAB5S. M: DL2000 DNA marker; 1: phagemid pCANTAB5S; 2: pCANTAB5S digested with Xba I; 3: pCANTAB5S treated by CIP.

對33個Tat38-61(51N/55N) 隨機點突變組合文庫重組子質粒進行序列測定，證實插入的序列為Tat38-61(51N/55N) 突變體基因，被突變的氨基酸位點分別是K51和R55，且核苷酸序列均不相同，突變頻率的比較結果見表 2。單點核苷酸的突變頻率范圍為理論值的 12%~157%(實際出現次數與理論出現次數之比)；各點平均后的核苷酸的突變頻率范圍為理論值的 64%~172%。所對應的各氨基酸平均三點隨機突變頻率范圍為理論值的24%~283%，見表 3。51N-55N核苷酸序列與氨基酸序列均呈隨機排列組合，無偏向性，插入片段正反向均有 (24個正向，9個反向)，各種氨基酸及終止密碼子編碼在序列中分布均勻，表明本試驗所構建的噬菌體Tat38-61(51N/55N) 組合文庫以隨機方式組合。

圖4 PCR檢測文庫中不同大小插入片段克隆的分布Fig. 4 Distribution of colonies of inserted fragments with different size in combinatorial library detected by PCR. M: DL2000 DNA marker; 1?23: the number of 23 single colonies; 5S: the phagemid pCANTAB5S for positive control; C: the negative control.

表2 HIV-1 Tat38-61(51N/55N) 隨機突變組合文庫核苷酸突變頻率Table 2 Nucleotide mutation frequencies of the HIV-1 Tat38-61(51N/55N) combined site-directed random mutation library

表3 HIV-1 Tat38-61(51N/55N) 隨機突變組合文庫氨基酸突變頻率Table 3 Amino acid mutation frequencies of the HIV-1 Tat38-61(51N/55N) combined site-directed

3 討論

HIV感染所引起的艾滋病是全球重大公共衛生問題之一，目前缺乏有效的疫苗用于預防。雖然HAART療法能有效治療艾滋病，但終身服藥及抗藥性的產生限制了 HAART療法的療效，因此，治療性疫苗作為艾滋病防治的新方法正愈來愈受到重視。HIV Tat作為一種病毒毒素，在艾滋病致病中發揮重要作用，臨床研究發現，HIV感染者中 Tat抗體的水平與AIDS的發病呈明顯負相關，Tat抗體滴度高的感染者發病緩慢或長期不發病[18]。Tat蛋白可以誘導中和抗體，阻斷病毒復制和T細胞凋亡[19]，動物試驗表明，Tat疫苗引發了較強的抗體反應和T細胞反應，雖不能完全保護原發感染，但能明顯地降低病毒血癥，并具有長期的病毒感染抑制作用，顯示出Tat疫苗的應用價值[20]。因此，以Tat為靶分子的治療性疫苗研發顯得尤為重要。

本研究擬用分子進化技術這一新途徑尋找新型Tat免疫原。通過對天然Tat堿性區進行重組改造，使之成為制備新免疫原的候選物，應用噬菌體展示技術，構建由該區段51和55位氨基酸隨機突變體相互隨機連接的重復串聯體的噬菌體展示文庫，用含有高中和活性的抗-Tat兔血清進行進化篩選，以期獲得免疫原性更強、穿膜活性更低的突變體。研究表明，用重組表達的具有活性的 Tat分子能產生很好的免疫效果。

HIV Tat分子內包含很多抗原表位，其中主要為構象表位，如果用抗-Tat抗體對噬菌體展示全長HIV Tat突變體庫進行進化篩選會因為抗原抗體的相互作用過于復雜而得不到明確的結論，因此，我們選擇了HIV Tat分子內重要的功能區段堿性區進行展示。Tat分子具有天然非折疊蛋白的特征，屬于無規卷曲類型的分子，并且其構象處于快速動態的變化之中[21]，分子缺乏明確的高級結構，其抗原性受高級結構的影響很大，在 Tat堿性區內含有明確的線性抗原表位，但側翼序列對其有很大的影響，因此，明確 Tat38-61的抗原性是分子進化篩選必要的前提。為此，我們構建了pET32a-Tat(38-61) 融合蛋白，采用本實驗室獨立制備的兔抗 PEPTIDE-Tat(1-101)血清以及上海市公共衛生中心提供的HIV陽性血清進行ELISA檢測，結果表明Tat38-61與兔抗Tat血清及抗 HIV Tat陽性感染者血清特異反應，證明Tat38-61較好地保留了其抗原性 (數據未顯示)。

由于Tat38-61編碼序列較短，通過PCR對其51和55位氨基酸進行隨機化難度較大，我們首先對全長Tat1-101的51和55位氨基酸進行隨機化，再以此為模板PCR擴增Tat38-61編碼序列，結果順利地獲得了51和55位氨基酸隨機化的Tat38-61編碼序列并成功構建了其噬菌體展示文庫，該庫容量為5.0×106，滴度為 2.65×1012TU/mL，片段插入率為56.5%。序列分析顯示該文庫中51、55位核苷酸的分布狀況與NNS隨機化的理論預測值相近 (表2)，所編碼氨基酸的情況與隨機化的理論預測值也相近(表3)。另外，正向插入與反向插入序列也均出現，符合隨機分布的規律。這些結果均表明所構建的文庫顯示出良好的隨機性，達到了對該文庫進行分子進化篩選的要求，為后續的分子進化篩選、新型Tat突變體的獲得及疫苗候選物的構建奠定了基礎。

綜上所述，我們成功構建了 HIV-1株Tat38-61(51N/55N) 堿性區突變體文庫，并且其庫容、多樣性、隨機性均達到文庫構建要求，本實驗室已將該文庫展示于絲狀噬菌體表面，且通過用不同抗體及血清對文庫進行親和篩選，進一步研究HIV-1 Tat38-61表位的分子進化篩選，以期獲得理想的免疫原。

[1] Apolloni A, Hooker CW, Mak J, et al. Human immunodeficiency virus type 1 protease regulation of Tat activity is essential for efficient reverse transcription and replication. J Virol, 2003, 77(18): 9912?9921.

[2] Aoki Y, Tosato G. HIV-1 Tat enhances Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) infectivity. Blood, 2004, 104(3): 810?814.

[3] Ai Q, Wang LM, Xia W, et al. Research on HIV-1 Tat protein structure and functions. Chin J Cell Mol Immunol, 2005, 21(S1): 133?135.艾菁, 王麗梅, 夏威, 等. Tat蛋白結構與功能研究的進展. 細胞與分子免疫學雜志, 2005, 21(S1): 133?135.

[4] Campbell GR, Pasquier E, Watkins J, et al. The glutamine-rich region of the HIV-1 Tat protein is involved in T-cell apoptosis. J Biol Chem, 2004, 279(46): 48197?48204.

[5] Zocchi MR, Rubartelli A, Morgavi P, et al. HIV-1 Tat inhibits human natural killer cell function by blocking L-type calcium channels. J Immunol, 1998, 161(6): 2938?2943.

[6] Lin JP, Yu YL, Wang LY. Research on HIV-1 Tat protein pathogenic effect of extracellular HIV-1 Tat protein and research on vaccine. Foreign Med Sci: Sect Immunol, 2005, 28(2): 76?79.林劍平, 于永利, 王麗穎. 細胞外 HIV-1 Tat蛋白的致病作用及其疫苗研究進展. 國外醫學: 免疫學分冊, 2005, 28(2): 76?79.

[7] Teng JF, Pan W. Biological characteristics and pathogenic effect of HIV-1 Tat protein. Chin J Biol, 2009, 22(4): 406?410.滕競飛, 潘衛. HIV-1 Tat的生物學特性及其致病效應.中國生物制品學雜志, 2009, 22(4): 406?410.

[8] Jeang KT, Xiao H, Rich EA. Multifaceted activities of the HIV-1 transactivator of transcription, Tat. J Biol Chem, 1999, 274(41): 28837?28840.

[9] Ensoli B, Fiorelli V, nsoli F, et al. Candidate HIV-1 Tat vaccine development: from basic science to clinical trials. AIDS, 2006, 20(18): 2245?2261.

[10] Delom F, Fessart D, Caruso ME, et al. Tat-mediated protein delivery in living Caenorhabditis elegans. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 352(3): 587?591.

[11] Fiorelli V, Barillari G, Toschi E, et al. IFN gamma induces endothelial cells to proliferate and to invade the extracellular matrix in response to the HIV-1 Tat protein: implications for AIDS-Kaposi’s sarcoma pathogenesis . J Immunol, 1999, 162(2): 1165?1170.

[12] Epstein LG, Gelbard HA. HIV-1-induced neuronal injury in the developing brain. J Leukoc Biol, 1999, 65(4): 453?457.

[13] Moreau E, Belliard G, Partidos CD, et al. Important B-cell epitopes for neutralization of human immunodeficiency virus type 1 Tat in serum samples of humans and different animal species immunized with Tat protein or peptides. J Gen Virol, 2004, 85(S10): 2893?2901.

[14] Girard MP, Osmanov SK, Kieny MP. A review of vaccine research and development: the human immunodeficiency virus (HIV). Vaccine, 2006, 24(19): 4062?4081.

[15] Longo O, Tripiciano A, Fiorelli V, et al. Phase I therapeutic trial of the HIV-1 Tat protein and long term follow-up. Vaccine, 2009, 27(25/26): 3306?3312.

[16] Mayol K, Munier S, Beck A, et al. Design and characterization of an HIV-1 Tat mutant: inactivation of viral and cellular functions but not antigenicity. Vaccine, 2007, 25(32): 6047?6060.

[17] Chen L, Deng SH, Cao J, et al. Effective expression and immunogenicity analysis of HIV-1 HXB2 subtype Tat protein deleted the cysteine-rich region in E. coli. Chin J Microbiol Immunol, 2008, 28(5): 404?410.陳璐, 鄧松華, 曹潔, 等. 缺失半胱氨酸富集區的HIV-1 HXB2株Tat蛋白在大腸桿菌中的高效表達及免疫原性分析. 中華微生物和免疫學雜志, 2008, 28(5): 404?410.

[18] Zagury JF, Sill A, Blattner W, et al. Antibodies to the HIV-1 Tat protein correlated with nonprogression to AIDS: a rationale for the use of Tat Toxoid as an HIV-1 vaccine. J Hum Virol, 1998, 1(4): 282?292.

[19] Belliard G, Hurtrel B, Moreau E, et al. Tat-neutralizing versus Tat-protecting antibodies in rhesus macaques vaccinated with Tat peptides. Vaccine, 2005, 23(11): 1399?1407.

[20] Maggiorella MT, Baroncelli S, Michelini Z, et al. Long-term protection against SHIV89.6P replication in HIV-1 Tat vaccinated cynomolgus monkeys. Vaccine, 2004, 22(25/26): 3258?3269.

[21] Shojania S, O’Neil JD. HIV-1 Tat is a natively unfolded protein: the solution conformation and dynamics of reduced HIV-1 Tat-(1-72) by NMR spectroscopy. J Biol Chem, 2006, 281(13): 8347?8356.