PCR-SSP法在強直性脊椎炎患者中HLA-B27的診斷作用

周建月,田曉豐（.廣西醫科大學第一附屬醫院輸血科,廣西南寧 53002;2.吉林大學普外科中心,吉林長春 3004）

*通訊作者

HLA-B27是人類白細胞抗原B位點上的一個重要的等位基因,與脊椎關節系統疾病如強直性脊柱炎（AS）、反應性關節炎（ReA）、Reiter氏綜合征（RS）等許多嚴重危害人類健康的疾病密切相關。HLAB27的檢測有血清學檢測和PCR技術檢測兩種,我們對疑為強直性脊椎炎患者的HLA-B27進行了兩種方法的檢測,報告如下。

1 材料和方法

1.1 標本來源 36例廣西省各醫院可疑強直性脊椎炎患者標本。

1.2 HLA-B27血清學分型 取患者EDTA抗凝全血3.5ml,其中3 m l用于微量淋巴細胞毒試驗檢查HLA-B27抗原,預留0.5m l用于DNA的提取。檢定血清板含有陽性對照、陰性對照及4份抗B27血清。

1.3 HLA-B27 PCR-SSP基因檢測

1.3.1 制備DNA模板 用預留的0.5 ml全血采用快速鹽析法提取DNA,5μl純凈水溶解。

1.3.2 HLA-B27 PCR引物設計根據HLA-B27基因序列設計引物為5'-CAGTCTGTGCCTTGGCGTTGC-3';5'-GGCTACGTGGACGACACGCT-3',PCR產物為144 bp。內對照為人類生長激素（HGH）基因特異性引物,HGH-A鏈引物序列為:5'-TGCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3',HGH-B鏈引物序列為:5'-CCACTCACGGATTTCTGTTGTGTTTG-3',擴增產物為434 bp。

1.3.3 PCR擴增體系為50μl:DNA Taq酶0.5u,10×PCR buffer 5μl,dNTP:1mM,每條引物終濃度 1μM和DNA 2μg;循環參數為 94℃,5 min;94℃,30 s;60℃,30 s;72℃,50 s;30個循環后72℃,5 min結束擴增后2%瓊脂糖電泳30 min后,凝膠成像記錄結果。

2 結果

2.1 血清學檢測結果 36份標本血清學檢測出17份HLA-B27抗原陽性,14份HLA-B27抗原陰性,5份血清學結果可疑。

2.2 PCR檢測結果 有美國G&T提供4份含有HLA-B27基因的DNA標準品和4份無HLA-B27基因的DNA標準品作為擴增判定標準。檢測有HLAB27基因的,出現434 bp內對照帶和144 bp特異性帶。檢測沒有含有HLA-B27基因的,僅出現434 bp內對照帶,不出現144 bp特異性帶。同次擴增DNA標準品結果正確無誤。36份標本均重復2次,檢測結果一致。如圖1所示。

2.3 PCR檢測結果中20例有HLA-B27基因,其中17例是血清檢測陽性結果樣本,另3例是血清學檢測結果可疑樣本。16例無HLA-B27基因,其中14例是血清檢測陰性結果樣本,另2例是血清學檢測結果可疑樣本。

圖1 HLA-B27 PCR擴增結果示意圖

2.4 本試驗36例樣本 以PCR-SSP技術檢測有HLA-B27基因者20例,其中19例樣本達到AS臨床診斷標準,1例不能確診為AS。

3 結論

AS是一種主要侵犯脊柱并可不同程度累及骶髂關節和周圍關節的慢性進行性炎性疾病,HLAB27抗原與AS具強相關性[1],HLA-B27陽性在AS的診斷中具有較高的價值。廖艷秋[2]等認為,如果病人診斷AS的可能性為50%,若病人B27陽性,則診斷AS的概率提高到95%左右,若該患者B27陰性,則患AS的概率降至3%左右。所以能否正確判定HLA-B27抗原對于診斷非常重要。采用血清學檢測的缺點是:要求新鮮血至少3ml及足夠量的活淋巴細胞。難以獲得強度為100%的HLA-B27單抗血清,不同廠家的抗血清質量難以統一,不同批號之間存在亞型特異性等諸多問題。幾份血清血檢測結果不一致時難以下結論,對于這樣的可疑樣本人為主觀判斷因素影響大。而PCR檢測技術對樣本要求不高,血樣或提取的DNA均可長期保存,便于重復檢測。PCR操作簡便、結果可靠,準確性和重復性強。對于HLA-B27的檢測用PCR方法優于血清學方法。

[1][1]Mcmichel A,Bell J.HLA-B27:a disease-associated immune response gene[J].Res Immunol,1991,142:475.

[2]廖艷秋,陶良軍,王紅梅,等.HLA-B27的檢測極其臨床意義的探討[J].中國輸血雜志,2001,14（6）:373.