腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體對膠質瘤細胞的誘導凋亡作用

嚴 海,張 宇,于洪泉*,齊 玲,金 宏,姜亞磊,胡曉勇

（1.北華大學第二臨床學院腦外科;2.吉林大學第一醫院神經外科,吉林長春 130021;3.吉林醫藥學院病理教研室）

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）可以誘導多種腫瘤細胞發生凋亡,并且對正常細胞沒有明顯的毒性作用,因此在美國已進入臨床Ⅱ期藥物開發階段[1]。膠質瘤是中樞神經系統發病率最高的腦腫瘤,除手術切除外,現有放、化療等方法對于患者生存期的延長意義不大。國外已有TRAIL可以誘導多種膠質瘤細胞凋亡的報道[2],國內未見同類報道。因此,我們提出對原代培養的膠質瘤細胞經TRAIL誘導凋亡作用進行研究,為TRAIL作為腫瘤治療新藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養[3]取新鮮人腦膠質瘤組織（吉林大學第一臨床醫院提供,病理診斷為Ⅲ-Ⅳ級腦膠質瘤）。去除壞死、出血部分。冷PBS沖洗后將組織剪成小塊（1mm×1mm大小）,置于離心管中,加入0.25%胰酶,37℃振蕩孵育30-45 min,離心棄上清,培養液重懸細胞,計數活細胞,加入 10%DMEM/F12（Gibco）培養液,以1×106/75 cm2密度接種,將培養瓶置入37℃、5%CO2孵箱、飽和濕度下進行培養,隔日換液,1∶3傳代。

1.2 TRAIL對膠質瘤細胞誘導凋亡作用[4]細胞融合至85%,0.25%胰酶消化,計數活細胞,以每孔8×103個細胞接種于 96孔板中,培養24 h,將細胞分為4組,加入TRAIL（100 ng/ml）,對照組使用基礎培養基。作用24 h后,小心棄上清,PBS洗去培養基,每孔加入酸性磷酸酶底物檢測溶液（用對硝基苯新鮮配制）100μl,繼續培養90min,加入終止液,室溫下孵育5min。酶標儀405 nm處測定各孔光吸收值。

2 結果

2.1 膠質瘤細胞生長情況 膠質瘤細胞經酶消化分離后培養,細胞生長情況良好,鏡下觀察2 h細胞開始出現貼壁生長,12 h左右大部分細胞均已發生貼壁,僅有少量細胞發生死亡,細胞伸展,在細胞的兩極開始出現突起,胞體呈長橢圓形,也可見其他不同形態的細胞。

2.2 TRAIL誘導膠質瘤細胞凋亡情況 取獲得的三株原代培養膠質瘤細胞株,未加TRAIL的對照組結果分別為0.23±0.02,0.51±0.02,0.36±0.01;經TRAIL作用后,測定結果分別為0.24±0.01,0.12±0.01,0.22±0.01。在三株原代培養的腦膠質瘤細胞中,GC321和GC125對兩株細胞對TRAIL的敏感性較高,結果有顯著性差異（P＜0.01）,而GC417則表現為稍有增殖（見表1）。

表1 TRAIL作用于膠質瘤細胞誘導凋亡情況（±s±s）GC417 GC321 GC125對照組 0.23±0.02 0.51±0.02 0.36±0.01 TRAIL組 0.24±0.01 0.12±0.01* 0.22±0.01*與對照組相比:*P＜0.01

3 討論

膠質瘤是起源于中樞神經系統的最常見腫瘤,其發病率并不高,但由于其隱匿性,一經發現病理診斷就是Ⅲ-Ⅳ膠質瘤,其死亡率極高。并且由于在腦內呈彌散分布[5],手術難以清除,即使清除,也由于散布有腫瘤細胞,使膠質瘤易復發。TRAIL研究過程中遇到過很多問題,但它作為體內免疫系統可以正常表達的產物[6],一直倍受關注。

人們想通過一種天然物質或天然抗腫瘤機制的研究,找到一種理想的腫瘤治療新藥。TRAIL研究中發現,它可以誘導多種腫瘤細胞發生凋亡[7],但同時在多種腫瘤來源的細胞株中也廣泛存在著藥物耐受和抵抗現象[8],并且到目前為止,科研人員還在對抵抗或耐受的機制研究做著不懈的努力。由于大部分的研究都是針對已獲得的腫瘤細胞株,但對于從病人獲得的原代培養的細胞株,國內研究還較少,因此,我們從臨床上獲得腦膠質瘤組織,分離出膠質瘤細胞,對TRAIL進行研究。

結果發現,雖然同為原代培養的膠質瘤細胞,但三株細胞TRAIL的反應也不相同,有一定差異。其中,GC417對TRAIL完全不敏感,甚至在100 ng/m l TRAIL作用后,細胞仍出現輕微的增殖反應。而GC321則對TRAIL非常敏感,在100ng/ml TRAIL作用后,出現明顯的細胞凋亡反應。而GC125介于兩者之間。這說明,不同來源的膠質瘤細胞對TRAIL的反應性不同,但是什么原因導致了細胞對TRAIL的反應不同,還需要進一步研究,并明確在細胞中,決定藥物敏感性的因素。

[1]Anita C,Ling Qi,Patrick Mulligan,etal.TRA ILAgonistsonClinical Trials for Cancer Therapy:The Promises and the Challenges[J].Reviewson RecentClinical Trials（Online）.2009,（4）:34.

[2]Song JH,Bellail A,TseMC,etal.Human Astrocytes Are Resistant to Fas Ligand and Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand-Induced Apoptosis[J].Neuroscience.2006,26（12）:3299.

[3]齊 玲,金 宏,丁麗娟,等.腦腫瘤干細胞的培養及生物學特性研究[J].中國實驗診斷學.2011,15（2）:227.

[4]畢莉莉,齊 玲,李景輝,等.老年腦萎縮患者血清中TNF表達[J].中國實驗診斷學.2011,15（2）:335.

[5]Holland EC,G lioblastomamultiforme:the term inator[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97（12）:6242.

[6]Smyth MJ,Takeda K,Hayakawa Y,et al.Nature's TRAIL-on a path to cancer immunotherapy[J].Immunity.2003,18（1）:1.

[7]Griffith TS,Anderson RD,Davidson BL,et al.Adenoviral-mediated transfer of the TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2 ligand gene induces tumor cell apoptosis[J].JImmunol.2000,165（5）:2886.

[8]Guo L,Fan L,Pang Z,et al.TRAIL and doxorubicin combination enhancesanti-glioblastoma effect based on passive tumor targeting of liposomes[J].JControl Release.2011.[Epub ahead of print].