心臟特異表達Calponin 1轉基因小鼠的心臟功能分析

王書美，呂 丹，陳 煒，張曉娟，曹興水，張連峰，2

（1.中國醫學科學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021；2.中國醫學科學院實驗動物研究所，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，中國醫學科學院和北京協和醫學院，北京 100021）

Calponin 1（CNN1）基因編碼的堿性調寧蛋白（calponin 1，CNN1）是一個首先從雞砂囊和牛主動脈中分離出的相對分子質量為3.4×104的堿性蛋白［1，2］。它主要在平滑肌細胞中表達，具有很強的組織特異性，結合肌動蛋白，原肌球蛋白，鈣調蛋白［1，3，4］，抑制肌球蛋白的ATP酶活性［5］，在固定化的肌球蛋白抑制Ca2+-依賴的肌動蛋白的移動性［6］，誘導肌動蛋白絲的構象改變［7］，參與平滑肌收縮。

20世紀90年代，CNN1作為平滑肌分化的標記，研究主要集中在其結合肌動蛋白，抑制肌球蛋白ATP酶（myosin ATPase，簡稱ATP酶）方面。近年來，發現CNN1可調節肌動蛋白細胞骨架的穩定性，認為CNN1可作為重要的信號轉導和整合分子［8］。現在研究也表明CNN1不僅作為平滑肌分化的可靠標記，還可預測腫瘤轉移及患者的預后情況。其表達改變與許多疾病的發生、發展密切相關，研究其生化特征及生化分子機制，能為預防和治療平滑肌疾病及腫瘤，提供理論與實驗基礎。

在鼠類胚胎發育過程中，在9.5d胚胎的背主動脈，心臟流出管道，管型心臟中可監測到CNN1，隨后的發育過程中血管平滑肌組織中CNN1表達上調，而在心臟中的表達下調至檢測不到的水平，表明CNN1參與心肌纖維發育，調節胚胎期心臟的收縮［9］。Tan等［10］基因芯片結果中顯示心力衰竭患者中CNN1表達比非心力衰竭者下調，本實驗也發現cTnTR141W擴張型心肌病模型小鼠心臟中CNN1表達比野生型小鼠降低，推測其對心臟發育及心血管系統可能具有重要的作用。CNN1過表達對心臟會有怎樣的影響，對心臟的發育是有利還是不利的，本文因此建立了心臟特異表達CNN1的轉基因小鼠，以對其生理功能，特別是對心臟正常發育可能存在的作用進行初步研究。

1 材料和方法

1.1 CNN1表達載體的構建及轉基因小鼠的制備

以pBluescriptR-CNN1質粒（Open Biosystems，美國，Clone ID4824832）為模板，用PCR法擴增人CNN1全長cDNA，將擴增片段插入pMD18T載體，經測序并比對正確無突變堿基后，以Sal I（寶生物工程有限公司，中國）酶切回收CNN1片段，并克隆入α-MHC啟動子下游構建心臟特異CNN1表達載體。提取并酶切鑒定質粒正確后，用Not I將其線性化，SephedexG50柱純化DNA片段，獲得α-MHC啟動的CNN1基因的轉基因片段，注射前將轉基因片段的濃度調整至5ng/μL，用顯微注射法將線性化的轉基因表達載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中（小鼠購自中國醫學科學院實驗動物研究所，康藍公司XCXK京2004001），用ICR小鼠作假孕受體（本實驗室飼養），制備轉基因小鼠（TE2000U顯微注射儀）［11］。實驗中涉及動物的操作程序已經得到中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準（GC-08-2035）。

1.2 PCR法鑒定CNN1轉基因小鼠的基因型

轉基因小鼠在出生9～14d用剪趾法編號，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA［12］，用PCR法對轉基因小鼠進行基因型檢測。PCR上游引物為：5′AAGGGCGGAACATCATTGGGCT 3′，下游引物為：5′CTCGAAGATCTGCCGCTTGGT 3′（invitrogen）。PCR反應體系20μL（試劑購自寶生物工程有限公司，中國）。反應條件：94℃預變性3min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環。CNN1目的片段為215bp。

1.3 Western Blot

將小鼠脫頸椎處死后，取100mg心臟組織加入1mL預冷的蛋白裂解液，冰上充分研磨，之后冰上靜置30min，再將組織勻漿于4℃，12000r/min離心30min，吸取上清即為心臟組織總蛋白。取50μg蛋白，12％的SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉移到0.45μm硝酸纖維素NC膜上（Millipore，美國）。將NC膜放入5％脫脂奶粉封閉液，室溫下置搖床上封閉1h，再用TBST稀釋的兔抗人Calponin 1單克隆抗體（ab46794，Abcam公司，美國）（1∶20000稀釋），4℃雜交過夜。次日，TBST洗3次，每次5min。將膜轉移到TBST稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體（Pierce，美國）（1∶15000），室溫雜交1h，采用HRP-GAPDH作為內參（康成生物，中國），TBST洗3次，每次5min。將膜置于化學發光液中，X-ray膠片曝光、顯影及定影。

1.4 超聲檢查CNN1轉基因小鼠

選用3月齡的轉基因陽性和同窩陰性對照小鼠，用三溴乙醇（0.2mL/10g體重）麻醉，脫去心前區的被毛，選用30Hz的探頭，按Zhou［13］報道的方法進行心臟超聲影像分析（Vevo770小動物超聲探測系統，加拿大）。

1.5 組織學檢測

選用6月齡的轉基因陽性和同窩陰性對照小鼠，頸椎脫臼法犧牲小鼠，打開胸腔取出心臟，將心臟組織固定在中性福爾馬林中24h，進行脫水、包埋、切片、HE染色和Masson染色。

1.6 統計學分析

數據SPSS統計軟件處理。先進行數據的方差齊性檢驗，組間比較采用獨立性t檢驗。計量數據用均數±標準差（±s）表示。

2 結果

2.1 CNN1基因在小鼠心臟組織中的表達

分別提取新生、14d，30d，90d的野生型小鼠，3月齡cTnTR141W和cTnTR92Q轉基因小鼠［14，15］的心臟組織總蛋白，用Calponin 1單克隆抗體進行Western Blot分析，結果CNN1在不同年齡的野生型小鼠心臟中均有表達，且表達隨小鼠年齡的增長略有下調（圖1A），同時發現CNN1在擴張型心肌病模型小鼠心臟中表達降低，肥厚型心肌病模型小鼠心臟中表達升高（圖1B）。

圖1 CNN1基因在小鼠心臟組織中的表達Fig.1 Expressions of CNN1 gene in the heart tissues

圖2 CNN1轉基因小鼠的建立Fig.2 Generation of CNN1 transgenic mice

2.2 CNN1轉基因小鼠的建立

用PCR法克隆人CNN1基因，測序結果顯示克隆的cDNA同已報道的CNN1序列完全一致（GenBank No.NM_001299.4），將CNN1基因插入心臟特異表達的α-MHC啟動子下游，構建α-MHCCNN1轉基因表達載體（圖2A）。用顯微注射法將線性化的轉基因表達載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，轉入受體假孕ICR小鼠中，小鼠出生14d提取基因組DNA，用PCR擴增CNN1基因215bp目的片段，鑒定CNN1轉基因小鼠的基因型（圖2B），共得到4只首建鼠，且均可傳代。分別提取CNN1首建鼠的F1代陽性轉基因小鼠和同齡陰性對照小鼠心臟組織總蛋白，用CNN1單克隆抗體進行Western Blot分析，結果顯示5號及6號首建鼠心臟組織內CNN1蛋白表達量明顯高于同齡陰性對照小鼠（圖2C）。

2.3 超聲檢查CNN1轉基因小鼠的心臟幾何構型及心功能

將3月齡的CNN1轉基因小鼠和同窩陰性對照小鼠進行心臟超聲影像分析（表1，圖3），結果顯示，CNN1轉基因小鼠收縮期左室內徑（LVID，systolic）增加28％（P＜0.01，n=12），舒張期左室內徑（LVID，diastolic）增加16.2％（P＜0.01，n=12），收縮期左室后壁厚度（LVPW，systolic）減小15.7％（P＜0.01，n=12），舒張期左室后壁厚度（LVPW，diastolic）減小21％（P＜0.01，n=12），射血分數EF（ejection fraction）降低11.5％（P＜0.01，n=12），短軸縮短率FS（fraction shortening）降低14.6％（P＜0.05，n=12）。

表1 3月齡CNN1轉基因小鼠心臟結構和功能M型超聲分析（n=12）Tab.1 The cardiac structure and function analysis of 3-month transgenic mice by M-mode echocardiograph（n=12）

2.4 CNN1轉基因小鼠心臟病理檢查

將6月齡CNN1轉基因小鼠和同窩陰性對照小鼠的心臟進行病理解剖，并進行HE染色和Masson染色。HE染色可見CNN1轉基因小鼠心臟全心擴大，心臟室壁明顯變薄，心腔變大（圖4A，B），高倍鏡下可見心肌細胞不均勻肥大，細胞間隙變大（圖4C，D），Masson染色可見CNN1轉基因小鼠心臟心肌間質纖維明顯增多（圖4E，F）。（圖見封3）

3 討論

Calponins是肌動蛋白結合蛋白家族，在脊椎動物細胞中廣泛表達。按其等電點（isoelectric point，pI）分為堿性調寧蛋白（h1 calponin，CNN1，pI 8～10），中性調寧蛋白（h2 calponin，h2CaP，pI 7～8），酸性調寧蛋白（h3 calponin，h3CaP，pI 5～6）［16］。這3個成員的前273個氨基酸殘基具有很高的同源性（＞70％），都是由單一CH結構域（calponin homologydomain）和29個氨基酸殘基組成的CLR（calponin-like repeat）三拷貝串聯重復序列組成。但它們的羧基末端序列有較大的差異［17］。堿性調寧蛋白大多表達于終末分化和非增殖性的平滑肌細胞中，其在平滑肌組織中的含量與原肌球蛋白（tropomyosin）相似，為肌動蛋白的1/7。中性調寧蛋白主要分布于心肌組織中。酸性調寧蛋白是一種無組織表達特異性的變異體，其在腦組織中含量最豐富。

本文利用Western Blot檢測了CNN1在野生型小鼠心臟中的時程表達，出生后的小鼠心臟中均檢測到了CNN1的表達，并發現CNN1在cTnTR141W擴張型心肌病小鼠模型中的表達比野生型小鼠低，推測其對心臟發育及心血管系統可能具有重要的作用。

本文中，首建鼠Founder 5和Founder 6的后代小鼠PCR檢測結果顯示外源基因能穩定地傳遞到下代。Western Blot結果顯示，CNN1在5號和6號首建鼠心臟組織中與野生型小鼠相比有較高表達，表明成功建立了心臟特異表達的α-MHC-CNN1轉基因小鼠。

我們建立的心臟特異表達CNN1的轉基因小鼠的心臟超聲影像分析結果顯示，與野生型小鼠心臟相比，收縮期和舒張期左室內徑增加，收縮期和舒張期左室后壁厚度變薄，射血分數和短軸縮短率降低。心臟組織病理觀察結果顯示，CNN1轉基因小鼠心臟全心擴大，心臟室壁明顯變薄，心腔變大，高倍鏡下可見CNN1轉基因小鼠心肌細胞不均勻肥大，細胞間隙變大，心肌間質纖維明顯增多。

圖3 CNN1轉基因小鼠M型超聲分析截圖Fig.3 Analysis of the mouse heart by echocardiography

目前，關于心臟特異表達CNN1的轉基因小鼠尚未見報道，本文成功建立了心臟特異表達的α-MHC-CNN1轉基因小鼠，實驗發現，CNN1過表達可使心臟發生心腔增大，室壁變薄，心臟收縮功能減弱等改變，此轉基因小鼠的建立為進一步研究CNN1對心臟正常發育，以及對CNN1在心臟發育和心肌病的發生過程中的生物學功能及可能的機制加以研究，提供了有價值的模型動物。

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