利用人臍帶血干細胞制備人鼠肝組織嵌合體模型

周 笛，范 沛，張 建，顧為望，姚 剛，劉光澤

（1.南方醫科大學實驗動物中心暨比較醫學研究所，廣州 501515；2.新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052；3.解放軍第四五八醫院全軍肝病中心，廣州 510602）

人臍血中富含豐富的臍血干細胞，而且來源豐富、簡單易得，目前成為干細胞研究的應用熱點，臍血干細胞在誘導因子作用下可分化為肝細胞，這個在體外研究早已有報道［1，2］。這無疑給肝病的治療帶來很大的有利條件。據世界衛生組織調查，全球約有20億人感染過乙型肝炎病毒（HBV），其中3.5億是慢性HBV攜帶者。HBV又是肝細胞癌（HCC）的主要誘因，流行病學研究表明，乙肝與肝細胞癌（HCC）的發生密切相關［3，4］，因此HBV深切關系著人們的生命和健康。乙型肝炎的研究長久以來面臨缺少穩定可靠的HBV感染細胞模型和動物模型，從而阻礙了對HBV致病機制、抗病毒藥物篩選和疫苗研制等的研究進程。近年來隨著肝移植技術的迅速發展，小鼠肝臟嵌合人肝細胞將為人類針對人體肝臟疾病和肝細胞病毒的研究提供佳的體內模型［5］。我們以裸鼠作為受體，通過移植人臍血造血干細胞，探索建立一種制備人肝組織嵌合的動物模型可能性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：年齡為6周的雄性裸鼠（BALB/c nu-小鼠）21只（其中5只為對照組），體重18～22g；另選取年齡為6周、體重18～22g的雄性KM小鼠5只，作為對照組，均購自南方醫科大學實驗動物中心，飼養于中心SPF級動物實驗部［SCXK（粵）2006-0015］。

1.1.2 人臍帶血干細胞：由廣東省臍帶血造血干細胞庫（廣東省婦幼保健院）提供。

1.1.3 HBV陽性血清：由解放軍第四五八醫院全軍肝病中心提供，血清HBVDNA定量檢測為107copy/mL。

1.2 方法

1.2.1 人臍血干細胞的移植：取裸鼠17只作實驗組，每只經尾靜脈注射0.2μL人臍帶血干細胞，1周后，再次按同樣方法再次移植0.2μL人臍血干細胞。并持續觀察。

1.2.2 HBV的感染和檢測：移植干細胞后第21天經尾靜脈每只注射0.1mL人HBV血清。7d后取肝組織，HBsAg免疫組化檢測。

1.2.3 肝臟甲胎蛋白的免疫組化檢測：實驗組裸鼠經頸椎脫臼處死，取肝臟組織，大小約0.5cm×0.5cm×0.3cm，4％多聚甲醛固定，水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，脫蠟至水，3％H2O2處理15min，檸檬酸緩沖液微波抗原修復10min，一抗（兔抗AFP多克隆抗體，購自Invitrogen，編號：18-0055）。

1.2.4 血清甲胎蛋白和白蛋白的定量檢測：感染1周后取實驗組小鼠血清，經摘除眼球取靜脈血，每只約取1mL，4℃、3000r/min離心15min分離各約200μL血清，常規放射免疫法測定血清甲胎蛋白和全自動生化儀測定血清白蛋白含量。另用同樣方法定量檢測正常裸鼠和KM小鼠（各5只）血清作為對照組。

1.2.5 數據分析：利用SPSS13.0（SPSS Inc.U.S.A）分析數據。

2 結果

2.1 人臍血干細胞的移植

實驗組裸鼠共成功注射17只，其中2只非正常死亡，剩下15只生存狀態良好。

2.2 血清甲胎蛋白和白蛋白含量

不同組別間血清甲胎蛋白和白蛋白含量比較見表1。實驗組裸鼠肝組織的AFP含量顯著高于裸鼠和KM鼠的對照組（P＜0.05）；而實驗組裸鼠肝組織中的ALB含量則低于裸鼠和KM對照組（P＜0.05）。

表1 不同組別間AFP和ALB含量Tab.1 The contents of AFP and ALB in different groups

2.3 肝臟甲胎蛋白的表達

用免疫組織化學方法對移植人臍血干細胞的裸鼠于進行肝臟組織AFP檢測，移植后第7天（圖1）即可觀察到AFP陽性細胞存在，陽性細胞分布于肝表面及肝小葉內，AFP在細胞質內表達。再分別對移植后14d（圖2），21d（圖3）的小鼠肝臟檢測，均可見到AFP陽性肝細胞，表明嵌合的人肝細胞可一定時期在小鼠的肝臟內存在。（圖見彩插2）

2.4 乙肝血清病毒感染后肝臟HBsAg組化

乙肝血清病毒感染7d后，取小鼠肝臟組織HBsAg組化檢測，顯示陽性（圖4），顯微鏡低倍鏡下可顯示密集成片的陽性細胞。HBsAg在細胞質內表達，呈現棕黃色。表明人臍血干細胞在小鼠體內不僅存活，而且能被乙肝血清病毒感染。（圖見彩插2）

3 討論

干細胞能在正常肝臟內存活可分化成肝細胞［6］。臍血造血干細胞的含量等于或超過骨髓，并且常常高于成人外周血。造血干細胞進入體內后在肝臟內可以轉化為肝細胞或膽管細胞［7］。還有研究證明，臍血干細胞在小鼠體內可以自分泌方式提供自身某些生長因子，促進自身增殖分化［8］。BALB/c裸鼠先天性胸腺發育不良，體內T細胞數量明顯減少，缺乏細胞免疫功能，并且價格容易獲得，以此為實驗動物制備小鼠感染HBV的人鼠肝臟嵌合模型具有重要的意義。故本研究采用尾靜脈注射移植人臍帶血干細胞的方法制備人鼠肝嵌合體小鼠，方法簡便，成功率高。

AFP是人體胚胎時期胎兒肝細胞和卵黃囊內合成的一種糖蛋白，胎兒出生1～2周后迅速下降至成人水平（0～20μg/L）［9］。AFP的生成量和胎兒肝臟或肝細胞再生時的分裂細胞數量呈正相關，故有人認為AFP是由分裂增殖的肝細胞所產生，也可用于了解肝細胞再生情況［10］。因此我們以AFP作為檢測指標，用免疫組化法來檢測嵌合小鼠肝組織。臍血干細胞移植7d后采集小鼠肝臟標本檢測到AFP陽性細胞，AFP表達于肝細胞質中，染色細胞細胞質出現棕黃色顆粒。顯微鏡下觀察可見細胞呈圓形，類圓形，為成熟肝細胞表型，與正常肝細胞相似。之后又對第14天、第21天采集的小鼠肝臟標本進行AFP免疫組化檢測，陽性表達持續，分析人臍血干細胞在實驗組裸鼠的肝臟內分化成為有活性的人肝細胞。對照組肝臟組織中AFP則顯示陰性。HBV感染后7d，肝臟組織HBsAg免疫組化檢測顯示陽性。此外，RIA定量測定實驗組和對照組的AFP和ALB的統計結果顯示有顯著差異（P＜0.05）。實驗組的AFP明顯高于對照組，實驗組裸鼠肝臟組織經免疫組化可看到肝臟組織呈現棕黃色，表明有陽性細胞存在，提示有新的人肝細胞生成。

ALB主要由肝細胞合成分泌［11，12］，其它組織細胞分泌極少，是最常用和最可靠的肝細胞功能檢測指標。ALB的檢測可代表肝臟的合成和儲備功能。肝細胞的成熟會使ALB合成增多，而細胞的活力下降會使ALB合成減少。實驗組在感染后的ALB含量低于正常小鼠，提示肝細胞在體內存活并具有生物學特性。已有研究證明肝損傷可使ALB降低［13］，提示實驗組被感染肝臟肝功能受損、使蛋白質的合成、細胞內運輸和釋放發生障礙促使ALB低于對照組。

有人利用人類特有的肝臟細胞、膽管細胞、內皮細胞標記物來分析臍血干細胞移植小鼠肝臟細胞；用FISH試驗檢測人和鼠的DNA，RT-PCR檢測人ALB，結果表明：人血清白蛋白（hALB）、G蛋白（GS）、抗細胞角質蛋白-18（CK-18）、AFP、抗細胞角質蛋白-19（CK-19）、ALBmRNA、CK-18mRNA、AFPmRNA等在鼠肝組織中被發現［14-16］，證明了人類臍血干細胞可以在NOD/SCID小鼠肝內生長，并分化成為成熟肝細胞。另外，利用雙免疫熒光染色法（抗人類肝細胞和抗人類ALB抗體）亦可證明嵌合鼠肝臟內存在能產生ALB的臍血來源的實質細胞，表現與正常肝細胞一樣的雙核結構，并且持續到55周仍可被檢測到［16］，更是證明了這一理論的可靠性。所以，本實驗將人臍血干細胞移植到裸鼠肝臟內，并用HBV進行感染，制備了HBV人鼠嵌合肝模型。為進一步研究提供了實驗基礎，同時也為臍血干細胞在肝臟疾病中的應用提供了技術支持。

［1］王利，唐承薇，王春暉.VIP對人臍血CD34+細胞向肝系分化的影響初探［J］.四川大學學報（醫學版），2006，37（4）：578-582.

［2］Wolfgang W，Frederik W，Anja S.Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow，adipose tissue，and umbilical cord blood［J］.Exp Hematology，2005，33：1402-1416.

［3］Arbuthnot P，Kew M.Hepatitis B.virus variants in human hepatocellular carcinoma.In［J］.Exp Patho，2001，82（2）：77-100.

［4］駱抗先.乙型肝炎基礎和臨床（第2版）［M］.北京∶人民衛生出版社，1996：3-10.

［5］Dandri M，Burda MR，Torok E，et al.Repopulation of mouse liver with human hepatocytes and in vivo infection with hepatitis B virus［J］.Hepatology 2001，33（4）：981-988.

［6］Laurson J，Selden C，Hodgson HJ.Hepatocyte progenitors in man and in rodents-multiple pathways，multiple candidates［J］.lnt Exp Pathol，2005，86（1）：1.

［7］Wang XL，GeSL，GeorgeM，etal.Albumin2expressing hepatocyte-like cells develop in the livers of immune-deficient mice that received transplants of highly purified human hematopoietic stem cells［J］.Blood，2003；101（10）：4201-4208. hsp70［J］.EMBO J，1986，5：451-458.

［12］Keith B，Chua NH.Monocot and dicotpre-mRNAs are processed with different efficiencies in transgenic tobacco［J］.EMBO J，1986，5：2419-2425.

［13］Choo KH，Raphael K，McAdam W，et al.Expression of active human blood clotting factor IX in transgenic mice：use of a cDNA with complete mRNA sequence［J］.Nucleic Acids Res，1987，15：871-884.

［14］盧一凡，鄧繼先，肖成祖，等.內含子的位置不影響轉基因的表達［J］.生物技術通報，1998，4：68-71.

［15］Brumovsky P，Wiesenfeld-Hallin Z，Hokfelt T，et al.Phenotyping of sensory and sympathetic ganglion neurons of a galanin-over expressing mouse--possible implications for pain processing［J］.J Chem Neuroanat，2006，31：243-262.

［16］Schlifke I，Kuteeva E，Hokfelt T，et al.Galanin expressed in the excitatory fibers attenuates synaptic strength and generalized seizures in the piriform cortex of mice［J］.Exp Neurol，2006，200：398-406.

［17］Pirondi S，D’Intino G，Gusciglio M，et al.Changes in brain cholinergic markers and spatial learning in old galanin-over expressing mice［J］.Brain Res，2007，1138：10-20.

［18］Jacoby AS，Holmes F，Hort YJ，et al.Phenotypic analysis of Galr1 knockout mice reveals a role for GALR1 galanin receptor in modulating seizure activity but not nerve regeneration［J］.Lett Pept Sci，2002，8：139-146.

［19］Jacoby AS，Hort YJ，Constantinescu G，et al.Critical role for GALR1 galanin receptor in galanin regulation of neuroendocrine function and seizure activity［J］.Mol Brain Res，2002，107：195-200.

［20］Blakeman KH，Hao JX，Xu XJ，et al.Hyperalgesia and increased neuropathic pain-like response in mice lacking galanin receptor 1 receptors［J］.Neuroscience，2003，117：221-227.

［21］Weinshenker D，Hohmann JG，Steiner RA，et al.Phenotypic analysis of mice deficientin the type 2 Galanin receptor（GALR2）［J］.Mol Cell Biol，2005，25：4804-4811.

［22］Krasnow SM，Hohmann JG，Gragerov A，et al.Analysis of the contribution of galanin receptors 1 and 2 to the central actions of galanin-like peptide［J］.Neuroendocrinology，2004，79：268-277.

［23］Lang R，Gundlach AL，Kofler B，et al.The galanin peptide family：receptor pharmacology，pleiotropic biological actions，and implications in health and disease［J］.Pharmacol Ther，2007，115：177-207.