小鼠不同細胞間組蛋白修飾變化對MafA基因轉錄表達的影響

李明岳，鮑世韻，劉嘉林，鄭錦鋒，林寶行，余小舫

（暨南大學第二臨床醫學深圳市人民院，深圳 518020）

組蛋白在翻譯后的修飾中會發生改變，從而提供一種識別的標志，為其它蛋白與DNA的結合產生協同或拮抗效應，是一種動態轉錄調控成分［1］。染色質免疫共沉淀-實時定量PCR法（chromatin immunoprecipitation-real time quantitative PCR methods，CHIP-PCR）技術可以檢測特定DNA序列染色質的結構，能夠充分反映生理條件下的DNA與蛋白質相互作用的真實情況［2］。MafA基因又稱亮氨酸拉鏈蛋白Maf家族A（v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family protein A，MafA），是一個關鍵的基因特異性表達的調節器，對于胰腺生長和β細胞的分化及β細胞正常功能的維持起重要作用［3］。本研究采用CHIP-PCR技術比較小鼠胚胎干細胞（mouse embryonic stem cell，mES）、NIH小鼠成纖維細胞（NIH 3T3）和小鼠胰島素瘤β細胞（NIT-1）之間MafA基因轉錄起始區的組蛋白修飾變化，以管家基因MLH1為對照，探討組蛋白修飾對MafA基因轉錄表達的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

（1）129/J小鼠胚胎干細胞（40 XY）和γ射線照射處理的第3代昆明小鼠胚胎成纖維細胞由賽業（廣州）生物科技有限公司提供。小鼠成纖維細胞株NIH3T3細胞和小鼠β細胞株NIT-1細胞由中山醫科大學動物實驗中心細胞庫提供，上述兩細胞均來自美國ATCC細胞庫；（2）組蛋白H3K4三甲基化（histone 3 lysine 4 trimethylation，H3K4m3）抗體（Abcam）、組蛋白H3K9三甲基化（histone 3 lysine 9 trimethylation，H3K9m3）抗體（Abcam）、組蛋白H3乙酰化抗體（Upstate）、抗小鼠Ig-G磁珠（BioLabs）；（3）超聲儀器Bioruptor（Diagenode）、Nanodrop（Agilent）、TaKaRa PCR Thermal Cycler（寶生生物工程有限公司）、ABI 7700 Realtime PCR儀（ABI）；（4）引物設計軟件：Primer 5.0。

1.2 細胞的準備

1.2.1 mES細胞的培養：預先準備由明膠包被的六孔板培養器皿，飼養層細胞是經γ射線照射處理的第3代昆明小鼠胚胎成纖維細胞。加入解凍后的mES細胞懸液和129/J小鼠胚胎干細胞完全培養基，在37℃、5％CO2、80％相對濕度的培養箱中培養。復蘇后的第2天換用DMEM完全培養液，定期更換培養液，當mES細胞克隆較大或克隆間出現融合時，予傳代。培養時間為2周。

1.2.2 NIT-1細胞的培養：將解凍后細胞懸液移入培養器皿中，加入足量的DMEM完全培養基，置于37℃、5％CO2、80％相對濕度的培養箱中培養。復蘇后第2天更換培養液，待細胞長滿培養器皿80％后進行傳代。培養時間為2周。

1.2.3 NIH 3T3細胞的培養：方法同NIT-1細胞。

1.3 實驗方法

1.3.1 CHIP-PCR技術檢測組蛋白修飾

CHIP-PCR技術是研究蛋白與DNA之間在染色質環境下相互作用的一種常用方法，用于檢測每個候選靶基因的啟動子區域是否存在能與組蛋白及特定轉錄因子結合的特定DNA序列。一般有兩種方法，一種是使用標準微球菌核酸酶來消化細胞核；另一種是在細胞中加入甲醛或將細胞暴露在紫外射線使得染色質發生交聯。接著用超聲波將染色質切成300bp到1000bp之間的小片段，然后加入組蛋白修飾抗體以及偶聯Ⅱ抗磁珠進行孵育反應，利用磁鐵的吸引力將組蛋白修飾的DNA片段從待測樣品分離出來，采用酚-氯仿法純化DNA片段。最后用定量PCR法擴增DNA片段，其擴增產物的量即可反映該啟動子區中組蛋白修飾水平。

1.3.1.1 組蛋白修飾檢測樣本的制備：將3種細胞（1×107個細胞/瓶）分別用胰酶消化，用Bioruptor進行超聲處理后于2％瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1。將斷裂后的DNA片段分成兩份，一份進行免疫共沉淀反應，一份作為input對照（不做任何處理直接進行PCR反應）。在第一份DNA樣品中其余依次加入組蛋白H3K4m3抗體（或組蛋白H3K9m3抗體，或組蛋白H3乙酰化抗體）、G蛋白磁珠、抗小鼠IgG磁珠（磁珠偶聯Ⅱ抗），孵育后，緩沖液洗滌，去除未結合的DNA片段，蛋白酶K消化抗體，用酚-氯仿溶液進行DNA純化后，Nanodrop測DNA濃度。

圖1 DNA超聲處理后電泳圖Fig.1 DNA after ultrasonic treatment Electrophoresis

1.3.1.2 實時熒光定量聚合酶聯反應擴增目的基因啟動子區：將3種細胞純化的DNA進行實時定量PCR。采用ABI 7700 Realtime PCR儀對免疫沉淀中MafA基因和MLH1基因的DNA、input control和陰性對照進行擴增。測定標準曲線和熔解曲線，確保擴增的準確性和專一性，用Ct值表示樣品中模板的相對含量，數據采用2-△△CT法進行分析。引物設計如下：MafA（mm9_cpgIslandExt_CpG：187.chr15：75576482-75578594.長度185bp）：5′-CCTTGTACAGGTCCCGCTC-3′，5′-GGAGGTCATCC GACTGAAAC-3′；MLH1（mm9_cpgIslandExt_CpG：117.chr9：11117496 4-111175156.長度193bp）：5′-TTAACCGAGCCAGGGACTTT-3′，5′-GCTTCCAG AATTGCCGACAT-3′。所有基因PCR程序一致，均如下：95℃、10min，40個PCR循環（95℃、15s，60℃、60s，收集熒光）。為了建立PCR產物的熔解曲線，擴增反應結束后，95℃、2min，60℃、20s，99℃、10s，并從60℃緩慢加熱到99℃，退火溫度59℃。實驗重復3次。

1.3.2 實時定量逆轉錄PCR：檢測3種細胞MafA和MLH1基因的表達水平。Trizol抽提RNA，鑒定RNA純度及定量后，RNA逆轉錄成cDNA。以GAPDH基因作為內參。設計引物序列如下：MafA：5′-AAAGCGGTGCTGGAGGAT-3′，5′-GGTTCAGGTG GTGCTGGTA-3′；MLH1：5′-GC GGTTAGTCGAGAAC TGATA-3′，5′-AGTGAACTTCGTGCTTGGTG-3′；GAP DH：5′-GTCCAT GCCATCACTGCCAC-3′，5′-ATGA CCTTGCCCACAGCCTT-3′。熒光定量PCR反應體系及擴增條件與前相同。測定標準曲線和熔解曲線，確保擴增的準確性和專一性，用Ct值表示樣品中模板的相對含量，數據采用2-△△CT法進行分析。實驗重復3次。

1.3.3 統計學分析：數據經SPSS軟件13.0統計，采用單因素方差分析，兩兩比較則用t檢驗，進行相關分析。

2 結果

2.1 組蛋白修飾的檢測結果

用染色質免疫共沉淀法檢測3種細胞中基因的組蛋白修飾的狀況。以mES細胞為參照，結果提示：NIT-1細胞中MafA基因轉錄起始區的H3乙酰化和H3K4m3修飾水平明顯增高（P＜0.05），H3K9m3修飾水平明顯降低（P＜0.05）；基因MLH1轉錄起始區的H3乙酰化修飾水平降低而H3K4m3修飾水平增高，但無統計學意義（P＜0.05）。在NIH 3T3細胞中，MafA基因轉錄起始區的H3乙酰化和H3K9m3修飾水平明顯增高（P＜0.05），H3K4m3修飾水平明顯降低（F=0.277，P=0.013）；管家基因MLH1轉錄起始區的H3K9m3修飾水平增高（P＜0.05）（表1）。

表1 基因在不同細胞中組蛋白修飾的比較（±s，n=3）Tab.1 Gene histone modifications in different cells comparisons（±s，n=3）

表1 基因在不同細胞中組蛋白修飾的比較（±s，n=3）Tab.1 Gene histone modifications in different cells comparisons（±s，n=3）

注：a.P＜0.05與NIT-1細胞比較；b.P＜0.05與NIH3T3細胞比較Note：a.P＜0.05 vs NIT-1 cell.b.P＜0.05 vs NIH3T3 cell

組蛋白修飾 基因 小鼠胚胎干細胞 NIT-1細胞 NIH3T3細胞Histone modification Genes mES cell NIT-1 cell NIH3T3 cell H3乙酰化修飾水平（％） MafA 0.42±0.02a b 1.10±0.07 0.93±0.17 Levels of H3 acetylation acetylation modification（％） MLH1 2.47±0.35 1.91±0.29 1.69±0.19 H3K4m3修飾水平（％） MafA 1.69±0.14a，b 10.64±0.87 0.94±0.10 Levels of H3K4m3 modification（％） MLH1 8.37±0.49 12.91±1.63 7.87±1.41 H3K9m3修飾水平（％） MafA 0.17±0.003a.b 0.03±0.005 0.39±0.06 Levels of H3K9m3 modification（％） MLH1 0.66±0.06b 0.48±0.08 2.36±0.43

2.2 基因mRNA的表達水平

實時定量逆轉錄PCR檢測基因表達，MafA在NIT-1細胞表達，而在NIH 3T3和mES細胞基本不表達，前者與后兩者存在統計學差異（P＜0.05）。MLH1在3種細胞均表達，3者之間的表達水平無統計學差異（表2）。

表2 基因在不同細胞中mRNA表達水平比較（±s，n=3）Tab.2 mRNA expression level of gene in different cells comparisons（±s，n=3）

表2 基因在不同細胞中mRNA表達水平比較（±s，n=3）Tab.2 mRNA expression level of gene in different cells comparisons（±s，n=3）

注：★P＜0.05 3者之間存在統計學差異Note：★P＜0.05 statistical differences among three type cells

基因 小鼠胚胎干細胞 NIT-1細胞 NIH3T3細胞Genes mES cell NIT-1 cell NIH3T3 cell MafA 4.89E-05±0.24E-05 4.72E-03±0.17E-03★1.15E-04±0.19E-04 MLH1 1.10E-03±0.22E-03 1.21E-03±0.27E-03 0.97E-03±0.25E-03

2.3 相關分析

對基因的組蛋白修飾和基因表達進行相關分析。結果表明，MafA基因的表達與H3K4m3修飾存在直線相關（相關系數0.995，P＜0.01）；與H3K9m3修飾存在直線負相關（相關系數-0.751，P＜0.05），與H3乙酰化修飾無相關性。管家基因MLH1的表達與所檢測的組蛋白修飾無相關性。

3 討論

NIT-1細胞來源于NOD小鼠，是由SV40和大鼠胰島素基因的啟動子經轉基因方式產生永生化的β細胞系，具有與正常β細胞相似的基因表型，在葡萄糖的刺激下能夠分泌胰島素［4］。由于大量高純度的β細胞在獲取上存在困難，本實驗采用NIT-1細胞代替正常β細胞作為研究對象。

組蛋白修飾是表觀遺傳學的重要組成部分，可在基因的DNA序列不發生改變時，使特異性基因的表達發生改變，并且這種改變還能通過有絲分裂和減數分裂進行遺傳［5］。在機體中，細胞基本生命活動所必需的管家基因可在各個細胞中表達；特異性基因MafA雖存在于所有的細胞，隨著胰腺的發育，其表達最終僅局限在β細胞［6］，提示組蛋白修飾可能參與其中的調控。

組蛋白有多種共價修飾方式，其中H3乙酰化、H3K4m3和H3K9m3是修飾基因轉錄調控的重要機制［7］。H3乙酰化修飾使DNA與組蛋白間的靜電引力和空間位阻增大，兩者間的相互作用減弱，DNA易于解聚，染色質呈轉錄活性結構，進而激活基因轉錄。H3K4m3使組蛋白和DNA的結構由緊變松，靶基因才能和轉錄復合物相互作用，基因得以轉錄。H3K9m3能使組蛋白形成一個異染色質蛋白HP1（heterochromatin protein 1）或其他抑制性染色質因子的結合位點，HP1的結合進而會導致DNA分子上特定CpG島的甲基化和穩定的基因沉默。不同組蛋白修飾可依次發揮作用或組合在一起，形成一個修飾的級聯，它們通過協同或拮抗來共同發揮作用［8］。本研究發現，MafA基因在mES、NIT-1和NIH 3T3三種細胞中的差異表達與H3K9m3修飾存在直線負相關；與H3K4m3修飾存在直線相關。MafA基因的表達與H3乙酰化修飾無相關性，這可能跟H3K9m3和H3乙酰化修飾兩者間存在競爭性有關［9］。而MLH1基因的表達與組蛋白修飾不存在相關性。結果表明，H3K9m3與H3K4m3修飾能協同作用于MafA基因轉錄起始區，調控其表達。

MafA基因的表達可在β細胞分化的最后階段檢測到，其除了與Pdx-1和BE-TA2一起協同刺激胰島素基因表達［10］，還參與Pdx-1基因的表達調控，，是一個關鍵的基因特異性表達的調節器［11］。Zhao等［12］發現MafA基因敲除小鼠出生時的胰島在形態學上是正常的，但隨著年齡的增長，小鼠表現為葡萄糖刺激胰島素分泌受損和胰島組織結構的異常。可見，MafA基因與β細胞的分化密切相關。在胚胎干細胞分化過程中，隨著轉錄起始區H3K9m3與H3K4m3修飾水平的改變，MafA基因選擇性轉錄，胚胎干細胞能向β細胞定向分化；當MafA基因選擇性失活時，胚胎干細胞則失去向β細胞定向分化的能力。因而，在胚胎干細胞向β細胞分化過程中，MafA基因的H3K4m3與H3K9m3修飾調控機制具有重要的作用。

綜上所述，H3K4m3與H3K9m3修飾能相互協調，共同調控MafA基因的表達，對胚胎干細胞向β細胞分化具有重要的意義。

［1］SternerDE，Berger SL.Acetylation of histones and transcription related factors［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2000，64（2）：435-45

［2］Kuras L.Charaeterization of protein-DNA associationin vivoby chromatinimmunoprecipitation.［J］.Methods Mol Bio，2004， 284：147-162.

［3］Coolen M，Sii-Felice K，Bronchain O，et al.Phylogenomic analysis and expression pattern of large Maf genes inXenopus tropicalisprovide new insights into the functional evolution of the gene family in osteichthyans.［J］.Dev Genes Evol，2005，215（7）：327-329.

［4］Hamaguchi K，GaskinsHR，LeiterEH，etal.NIT-1，a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/L tmouse［J］.Diabetes，1991，40（7）：842-849.

［5］Peterson CL，Laniel MA.Histones and histone modifications［J］.Curr Biol，2004，14（14）：546-551.

［6］Matsuoka TA，ArtnerI，HendersonE，etal.TheMafA transcription factor appears to be responsible for tissuespecific expression of insulin.［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（9）：2930-2933.

［7］Jenuwein T，Allis CD.Translating the histone code［J］.Science，2001，293（5532）：1074-1080.

［8］Strahl BD，Allis CD.The language of covalent histone modifications［J］.Nature，2000，403（6765）：41-45.

［9］Litt MD，Simpson M，Gaszner M，et al.Correlation between histone lysine methylation and developmental changes at the chicken beta-globin locus［J］.Science，2001，293（5539）：2453-2455.

［10］Aramata S，Han SI，Yasuda K，et al.Synergistic activation of the insulin gene promoter by the β cell enriched transcription factors MafA，Beta2，and Pdx1［J］.Biochim Biophys Acta，2005，1730：41-46.

［11］Samaras SE，Zhao L，Means A，et al.The islet beta cellenriched RIPE3b1/Maftranscription factorregulates pdx-1 expression［J］.Biol Chem，2003，278：12263-12270.

［12］Zhao L，Gao M，Matsuoka TA，et al.The islet beta cellenriched MafA cativator is a key regulator of insulin gene transcription［J］.JBiolChem，2005，280（12）：11887-11894.