兩種自發性2型糖尿病小鼠生物學特性比較

李 娜，張 周

（中國科學院上海藥物研究所，上海 201203）

合適的糖尿病動物模型在糖尿病的發病機制研究及其并發癥的治療、藥物的開發過程中都發揮著極其重要的作用。國內外諸多學者均對KK小鼠或db/db小鼠的典型糖尿病特征進行研究，但卻未對其進行比較分析，故本實驗采用發病過程與人類糖尿病極其相似的自發性2型糖尿病動物模型KKAy/Ta和C57BL/KsJ-db/db小鼠為研究對象，對其體重、血糖、胰島素、臟器系數以及部分臟器病理學變化等生物學特性進行分析比較，為糖尿病病因及治療方法的研究提供基礎資料以便選擇合適的動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：實驗動物分為4組，分別為：糖尿病模型KK-Ay/Ta（以下簡稱KK）小鼠及對照組C57BL/6JSlac（以下簡稱C57）小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司［SCXK（滬）2007-0005］；糖尿病模型C57BL/KsJ-db/db（以下簡稱db/db）小鼠及對照組C57BL/KsJ-db/+（以下簡稱db/+）小鼠，由美國JACKSON實驗室引進的db/+小鼠在中國科學院上海藥物研究所交配繁殖的后代［SCXK（滬）2008-0017］；每組小鼠20只，雌雄各半，飼養于本單位動物屏障環境內［SYXK（滬）2008-0049］；溫度控制在20℃～25℃之間，日溫差≤3℃；相對濕度控制在40％～70％之間；每日12h光照維持，晝夜循環；自由進食、飲水，配合飼料（121℃高溫高壓滅菌25min）含粗蛋白20.5％、粗脂肪4.6％、粗纖維3.0％、鈣1.4％、總磷0.9％，購自上海仕林生物科技有限公司［飼料生產企業審查合格證編號：滬飼審（2008）04031］。

1.1.2 試劑：胰島素試劑盒（美國CRYSTAL CHEM公司生產）、甲醛溶液、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉。

1.1.3 儀器設備：OneTouch UltraTM血糖儀、OneTouch UltraTM試紙、分析天平、電子天平、毛細管、離心機、酶標儀、顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗周期：KK及對照組C57小鼠從6周齡開始，實驗至30周齡結束；db/db及對照組db/+小鼠從4周齡開始實驗，至20周齡結束。在各自實驗周期內，每2周測定模型小鼠與對照組小鼠的體重、血糖、血清胰島素水平；實驗結束后處死，分離心、肝、脾、腎、胰腺、腎周脂肪、皮下脂肪、腸系膜脂肪以及肩胛骨脂肪，稱重并計算臟器/脂肪系數；另對腎臟、肝臟和胰腺進行組織形態學觀察。

1.2.2 體重與糖代謝比較：每2周測定實驗小鼠體重與血糖值，分析比較不同年齡、不同性別的模型組與對照組小鼠體生長曲線和糖代謝曲線，分析各模型間達到血糖值異常的時間差異及峰值比較；血糖直接采用血糖儀測定尾靜脈血。

1.2.3 血清胰島素的比較：在各自實驗周期內，每2周眼眶采血200μL，3500r/min離心15min，取血清，-20℃保存，采用放射免疫分析法測定胰島素水平。

1.2.4 主要臟器、脂肪重量及臟器、脂肪系數的測定：實驗結束后，分別處死各實驗組及對照組小鼠，分離心、肝、脾、腎、胰腺、腎周脂肪、皮下脂肪、腸系膜脂肪以及肩胛骨脂肪，稱重；各臟器和脂肪重量以g為單位，臟器（脂肪）系數以臟器（脂肪）重量/體重×100％表示。

1.2.5 組織形態學觀察：分別將各實驗組及對照組小鼠的腎臟、肝臟和胰腺固定于10％中性福爾馬林溶液中＞24h，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，用高倍鏡觀察并拍照。

1.3 數據處理和統計學分析

所有數據用Mean±SE表示，采用SPSS13.0軟件進行統計學處理。差異顯著性采用獨立樣本t檢驗和單因子方差分析。

2 結果

2.1 體重的比較

KK和對照組C57小鼠、db/db和對照組db/+表型正常小鼠的體重均隨著年齡的增長而增加，并分別于6周齡和8周齡開始與其對照組相比差異顯著（P＜0.05），且同品系小鼠間雄性小鼠體重高于雌性，經分析可得出：自14周齡開始KK小鼠雌雄間相比差異顯著（P＜0.05），db/db小鼠在整個實驗周期內均呈現顯著差異（P＜0.05）；而兩品系間相比又可得出：KK小鼠體重遠高于db/db小鼠（P＜0.05），雄性KK小鼠體重最高達51.21±1.93g，雌性KK小鼠體重最高達42.73±2.76g；但雄性db/db小鼠則最高達38.69±3.66g，雌性最高值為35.64±3.48g（表1）。

表1 糖尿病模型KK與db/db小鼠體重（g）Tab.1 Body weight of diabetic KK and db/db mice（g）

2.2 血糖的比較

在整個實驗周期內，KK小鼠血糖值與對照組呈顯著差異（P＜0.05），雄性小鼠在10周齡時出現血糖異常癥狀（血糖≥13.9mmol/L），之后快速升高于12周齡達到最高值便逐漸降低但一直維持較高水平直至實驗結束；而雌性小鼠于12周齡時出現血糖異常現象，持續升高于18周齡達到最高值；另外，同周齡間的雄性小鼠血糖值明顯大于雌性小鼠（P＜0.05），其最高值分別為31.11±3.10和25.50±2.28mmol/L。db/db小鼠則在8周齡時就出現血糖異常癥狀并維持至實驗結束，同樣雄性小鼠的血糖值遠大于雌性小鼠（P＜0.05）。db/db小鼠出現血糖異常比KK早，且初期血糖值遠高于KK小鼠（P＜0.05），雌雄分別于12周齡和18周齡開始與KK小鼠處于相當水平，最高值可分別達到29.92±1.45和27.77±1.70mmol/L（表2）。

2.3 血清胰島素的比較

在整個實驗周期內，糖尿病模型KK與db/db小鼠與各自對照組均呈現顯著的差異（P＜0.05），且KK小鼠從6周齡開始就一直處于高胰島素水平狀態（≥10ng/mL），并很快達到峰值，而雄性和雌性db/db小鼠則分別于8周齡和10周齡開始處在高胰島素水平狀態至實驗結束；而同品系的雌雄小鼠間血清胰島素水平則基本上沒有差異（P＞0.05）；另外，同周齡內KK小鼠的血清胰島素水平明顯高于db/db小鼠（P＜0.05），雄、雌性KK小鼠的最高值分別為61.99±12.20ng/mL和62.35±15.61ng/mL，db/db小鼠分別為18.84±4.11ng/mL和17.03±3.71ng/mL（表3）。

2.4 主要臟器、脂肪重量及其臟器、脂肪系數的比較

2.4.1 臟器、脂肪重量比較

由結果（表4）分析得出，KK小鼠與其對照組相比，所有臟器、脂肪重量和體重差異顯著（P＜0.05）；同時，雄性KK小鼠的體重、肝臟、腎周脂肪、皮下脂肪、腸系膜脂肪和肩胛骨脂肪均明顯大于雌性小鼠（P＜0.05）。db/db與其對照組相比，部分臟器（如雄性的肝臟、脾臟，雌性的心臟、肝臟、脾臟和腎臟）以及所測脂肪的重量均呈現顯著差異（P＜0.05）；而不同性別的db/db小鼠間除脾臟外，其余臟器以及脂肪重量均沒有顯著差異（P＞0.05）。另外雄性KK小鼠的體重、心臟、脾臟以及胰腺重量明顯大于db/db小鼠（P＜0.05），但皮下脂肪和肩胛骨脂肪的重量則小于db/db小鼠（P＜0.05）；雌性KK小鼠體重、脾臟、胰腺、腎臟的重量大于db/db小鼠（P＜0.05），而腎周脂肪、皮下脂肪和肩胛骨脂肪的重量則遠小于db/db小鼠（P＜0.05）。

表2 糖尿病模型KK與db/db小鼠血糖（mmol/L）Tab.2 Glucose of diabetic KK and db/db mice（mmol/L）

表3 糖尿病模型KK與db/db小鼠血清胰島素（ng/mL）Tab.3 Serum insulin of diabetic KK and db/db mice（ng/mL）

2.4.2 臟器、脂肪系數比較

由結果分析可得出（表5），雄性KK小鼠的脂肪系數大于雌性小鼠，且均大于對照組（P＜0.05），但所測臟器則呈現不同程度的萎縮，尤其是雄性小鼠的心臟和腎臟萎縮程度明顯大于雌性小鼠（P＜0.05）。同樣db/db小鼠的脂肪系數也大于對照組（P＜0.05），且脾臟和胰腺也呈現不同程度的萎縮，但是雌雄間則沒有明顯的差異（P＞0.05）。另外db/db和KK小鼠相比表明，db/db小鼠脾臟和胰腺的萎縮程度明顯大于KK小鼠（P＜0.05），而KK小鼠肝臟的萎縮程度則大于db/db小鼠（P＜0.05），同時db/db小鼠的脂肪系數則遠大于KK小鼠（P＜0.05）。

表4 糖尿病模型KK和db/db小鼠的臟器、脂肪重量（g）Tab.4 Organ and adipose weight of diabetic KK and db/db mice（g）

表5 糖尿病模型KK和db/db小鼠的臟器、脂肪系數（％）Tab.5 Organ and adipose coefficient of diabetic KK and db/db mice（％）

2.5 組織病理學變化

各糖尿病模型和對照組相比，腎小球內玻璃樣變性、血管基底膜增厚、腎小管腔內透明管型、腎小管上皮細胞脂肪變性，且腎間質組織輕度充血、水腫，炎細胞浸潤；肝細胞大片壞死、伴隨有大量炎細胞浸潤以及纖維組織增生，肝細胞嚴重脂肪變性；胰島數量明顯減少、體積縮小，且島內細胞數量也相對減少、體積縮小，部分胰島完全萎縮、崩解（彩圖見封2）。

3 討論

自發性2型糖尿病動物模型是指實驗動物未經任何有意識的人工處理、在自然狀態下發生以高血糖、胰島素抵抗為主要特征的糖尿病模型，KK-Ay/Ta小鼠和db/db小鼠均是目前應用于人類2型糖尿病研究適用的自發性動物模型，KK-Ay/Ta小鼠是一種毛色基因（Ay）突變的2型糖尿病動物模型，Ay基因不僅影響小鼠的毛色而且可引起代謝紊亂，出現高飲食［1］、肥胖、高血糖、脂質代謝紊亂和和高胰島素血癥；db/db小鼠則是由美國Jackson實驗室于1966年在C57BL/Ks小鼠上發現的帶有糖尿病突變基因（db）的動物，該品系純合子小鼠早期發育時就會出現顯性糖尿病征兆。本實驗設計兩種品系糖尿病小鼠的起止周齡不一致，是因為作者結合國內外文獻報道以及早期預實驗而定，如Ito［2］研究得出KK小鼠于12周齡后體重、隨機血糖等指標均明顯高于對照組，出現典型的2型糖尿病癥狀，另有研究表明db/db小鼠于早期即出現糖尿病癥狀，故本實驗于6周齡和4周齡開始監測KK和db/db小鼠各項指標，同時研究得出db/db小鼠于16周齡即出現血糖和胰島素水平下降癥狀，即于20周齡結束db/db小鼠的實驗。

實驗研究得出KK小鼠體重遠高于db/db小鼠，體重最高值相差可達12g（雄性）與7g左右（雌性），且與對照組相比KK小鼠出現顯著差異比db/db小鼠早，于6周齡即出現明顯的體重異常。Amy［3］研究報道db/db小鼠的最高體重可達41.10±5.63g，Toshihiro［4］的研究中表明雌雄KK-Ay小鼠的平均體重在45g左右，較db/db小鼠高，與本實驗結果基本保持一致。

將血糖值進行比較則得出db/db小鼠出現血糖異常比KK早，且發病早期就呈現高血糖，早期血糖值比KK小鼠高，血糖變化曲線圖穩定，而KK小鼠發病后期可較長時間的維持血糖異常，維持時間較db/db小鼠長。Amy［3］的研究報道也表明出db/db小鼠的隨即血糖可達559±77mg/dl，即31.06±4.28mmol/L；而Satomi［5］研究得出KK小鼠的血糖最高值平均可達410mg/dl，即22.78mmol/L；同時Toshihiro［4］的研究也表明KK-Ay小鼠的血糖值可維持在400mg/dl左右。以上結果均與本實驗基本一致，綜合可得出KK小鼠的血糖值較db/db小鼠要低。

兩品系小鼠均呈現出高胰島素血癥，Tsukuda［6］研究分析該現象是由于大腦中過氧化物酶缺乏，持續的高胰島素分泌導致胰島素β細胞分泌較正常多幾倍甚至十幾倍來降低血糖，如此反復從而導致高胰島素血癥。另外實驗得出KK小鼠出現血清胰島素水平異常比db/db小鼠早，且遠高于db/db小鼠，從實驗開始就呈現極高的血清胰島素水平狀態直至實驗結束。KK小鼠最高可達60ng/mL，是db/db小鼠最高值的3倍。

實驗動物臟器重量和臟器系數是鑒定動物遺傳品質的重要依據［7］。本研究得出兩種糖尿病模型小鼠所有臟器及脂肪重量均明顯大于對照組，db/db小鼠的脂肪含量遠遠超過KK小鼠，而部分臟器則出現情況不等的萎縮癥狀，如db/db小鼠脾臟和胰腺的萎縮程度大于KK小鼠，而KK小鼠肝臟的萎縮程度則大于db/db小鼠，以上癥狀均說明這兩種糖尿病模型各自會影響免疫系統功能如脾臟，以及肝臟和胰腺的功能。

本實驗也得出KK小鼠和db/db小鼠會出現腎小管上皮細胞脂肪變性、蛋白管型，腎間質組織充血、水腫，炎性細胞浸潤等腎臟病變，可引發糖尿病腎病，與報道相符，如Ninichuk等［8］報道db/db小鼠在晚期會出現嚴重的腎臟病變、蛋白尿，透射電鏡觀察發現腺皮質線粒體變形、脂滴減少、細胞核變形、染色質邊集等異常病變；王謙等［9］對28周齡KK-Ay小鼠進行病理學研究分析得出其腎臟系膜增多，腎小管上皮細胞胞質出現明顯空泡，腎間質纖維化等系列病變。同時，實驗還得出這兩種動物模型均出現程度不等的肝細胞大片壞死、大量炎細胞浸潤以及纖維組織增生，且肝細胞嚴重脂肪變性，是研究糖尿病繼發病-肝臟疾病發病機理以及肝病藥物療效的有效動物模型，與文獻研究基本一致，如Yu等［10］報道KK-Ay/Ta小鼠可出現非酒精性脂肪肝，肝臟結構紊亂，肝細胞呈脂肪變形，肝組織纖維化。除此之外，Homo-Delarche［11］報道Ⅱ型糖尿病動物模型在病程早期出現胰島增生肥大，隨病程進展逐漸出現胰島數量減少、體積縮小、β細胞調亡，提示胰島β細胞調亡是造成胰島β細胞功能受損的重要原因，引起胰島結構破壞和功能受損，最終引起血糖控制上的惡化，而本研究也表現出晚期的胰島數量明顯減少、體積縮小，胰島內細胞數量減少、體積縮小，部分胰島完全萎縮、崩解，呈現β細胞凋亡，導致胰島功能受損，血糖控制無力。

綜合實驗結果可以得出，KK-Ay/Ta和C57BL/KsJ-db/db小鼠均是肥胖的，伴有高血糖、高度胰島素抵抗，肝臟、腎臟病變和胰島功能不足的適用性Ⅱ型糖尿病動物模型，同時db/db小鼠早期就表現出血糖異常，且血糖值高、相對穩定，雖然db/db小鼠的體重不及KK小鼠，但是db/db小鼠的脂肪含量明顯多于KK小鼠。而KK小鼠的血糖異常持續時間較長，且血清胰島素水平遠大于db/db小鼠，讀者可以根據實驗需求選擇合適的糖尿病動物模型。

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