I型小肽載體的結構及活性調控研究進展

河北農業大學動物科技學院 梁陳沖 陳寶江＊ 李紹華

蛋白質吸收代謝機制一直是動物營養研究的重點，傳統蛋白質理論認為蛋白質只有被降解成游離氨基酸才能夠被機體吸收代謝。當Ⅰ型小肽載體（PepT1）在腸道被成功克隆后，小肽能被小腸吸收的觀點才逐漸被廣泛地接受。韓非等（2003）報道，動物體內已發現的小肽轉運載體包括 PepT1、PepT2、PTR3、 大鼠的肽/組氨酸轉運載體（PHT1）和人的肽/組氨酸轉運載體（hPHT），其中研究最廣泛的是PepT1。小腸對小肽的吸收是通過位于小腸上皮細胞刷狀緣膜的H+耦合的肽轉運載體（PepT1）進行的，而質子是作為肽轉運的驅動力發揮作用的。迄今為止，PepT1是唯一被克隆的小腸肽轉運載體，已經分別從人類、鼠、家兔、綿羊、雞、豬和結腸癌細胞Caco-2中克隆出該載體蛋白 （Klang 等，2005；Chen 等，2002a、b；Pan等 ，2001；Walker 等 ，1998；Liang 等 ，1995；Satio等，1995；Boll等，1994）。

1 PepT1分子結構特征

目前對小肽轉運載體的基因和蛋白質結構的研究證明，兔子、大鼠、綿羊、奶牛、雞、豬和人的小腸 PepT1 mRNA 長分別為 2.9、2.9 ～ 3.0、2.8、2.8、2.9、3.5、3.3 kb （Pan 等，2001；Miyamote 等，1996；Liang等，1995；Fei等，1994）。 對 PepT1 分子結構的研究表明，不同動物的PepT1氨基酸序列長度存有差別，其中雞的序列最長，為714個殘基（Chen 等，2002a、b），牛和兔的最短，為 707 個殘基（Fei等，1994），但分子質量均為 79 kD，分子結構也相同，都有12個跨膜區域，并在9和10兩個跨膜區之間有一個較大的細胞外環，這也是轉運蛋白最顯著的特征；12個跨膜區域的氨基酸序列是高度保守的，但是細胞外環的氨基酸保守性較低，在細胞內環上有蛋白酶激酶C（PKC）和蛋白激酶A （PKA）的磷酸化作用位點；PepT1上的His-57和PepT2上的His-87是最關鍵的組氨酸殘基，他們可能是轉運蛋白發揮吸收功能時最關鍵的結合位點；不同動物肽轉運蛋白的氨基酸為707～729個，且不同動物相同器官肽轉運載體的同源性高，同種動物不同器官肽轉運載體的同源性低（韓非等，2003）。

2 PepT1組織分布

雖然不同動物PepT1的組織分布不同，但所有動物小腸都有PepT1表達，而在肌肉、心臟則未曾檢出PepT1 mRNA的存在，其他部位的表達情況則不同動物有所不同。Chen等（1999）研究表明，雞在小腸、盲腸、腎臟都有PepT1分布，嗉囊、腺胃和肝臟不存在；Fei等（1994）報道，兔除了小腸有PepT1的表達以外，在腎臟、肝臟和大腦也有少量存在，但胃和盲腸沒有表達；大鼠在腎臟有微量表達，肝臟中無表達；綿羊和奶牛的小腸、瓣胃和瘤胃有PepT1的表達，在真胃、肝臟、腎臟、盲腸和結腸中未檢測到。

Chen等（1999）報道，從PepT1在腸道的表達強度來看，不同動物也存在差異，雞主要以十二指腸為主，豬以空腸為主，反芻動物則以空腸和回腸為主。假設以mRNA豐度來表示小腸不同部位轉運蛋白的含量，那么可以認為在小腸各部位的轉運蛋白活性具有一定差異，這種種屬之間的差異可以反映出蛋白質消化部位和對小肽的利用程度。

3 PepT1的活性調控

PepT1是一類低親和力/高容量的肽載體，研究表明，底物、激素、生長因子、酶、飼糧營養水平和飼養管理等因素都能在一定程度上對其活性起到調控作用。

3.1 底物的調控 Pan等（2001）認為，PepT1對底物分子具有廣泛的適應性，幾乎可以轉運所有的二肽和三肽。此外，PepT1還可以轉運多肽類衍生物，其中包括β-內酰胺抗生素、血管緊張素轉化酶抑制劑、凝血酶抑制劑和類二肽抗癌藥物及多種藥物前體物。但體外細胞培養實驗發現肽載體對底物也有一定的選擇性，可以選擇轉運不同分子結構的底物。

小肽的轉運與底物的濃度也有關系，底物濃度高時轉運量較大。Erickson等（1995）在小鼠試驗中發現，高蛋白質（50%）日糧組小腸中段和遠端PepT1 mRNA豐度比低蛋白質（4%）日糧組高1.5～2倍。Shiraga等（1999）試驗也表明，在小鼠標準日糧中添加二肽（Gly-Phe），能增加PepT1基因表達。Chen等（2005）在雞的試驗中使用不同的飼糧蛋白質水平 （CP含量分別為12%、18%和24%），并保證各處理采食量相同，結果顯示，隨著蛋白質采食的增加，小腸中PepT1 mRNA豐度增加（P＜0.05），且在不同的組織中存在差異，空腸中PepT1 mRNA豐度高于十二指腸和回腸（P＜0.05）?？梢姡叩鞍踪|日糧增加了腸道中二肽、三肽和氨基酸的濃度，這些產物作為PepT1基因表達的信號因子，增加小腸刷狀緣膜上的肽轉運蛋白的水平，而最終使肽轉運增加。

Chen 等（2002b）進行的[3H]-Gly-Sar吸收的抑制試驗表明，二肽和三肽能明顯抑制[3H]-Gly-San的吸收，這說明這些小肽可能作用于相同的轉運位點，相互競爭，而該轉運載體對游離的氨基酸及四肽以上寡肽不進行吸收，因而對[3H]-Gly-Sar的吸收無抑制作用。施用輝等（1996）向來航公雞十二指腸灌注小肽的試驗結果表明，腸道吸收底物中小肽所占的比例是影響吸收速度的重要元素，小肽比例越高氨基酸吸收越快。孫炳偉等（2003）采用頭孢氨芐作為研究底物，Caco2細胞作為小腸上皮細胞模型，比較重組人生長激素對正常和缺氧復氧損傷后Caco2細胞PepT1功能的影響和調控作用，發現缺氧復氧損傷后，Caco-2細胞間隙增大，其特有的緊密連接結構被破壞；二肽載體的mRNA數量明顯降低；對頭孢氨芐的攝取量大大減少。

3.2 激素的調控

3.2.1 胰島素對PepT1的調節 胰島素被認為是代謝調控的一個重要因素，尤其對肌肉中葡萄糖和氨基酸的轉運調控。Nielsen等（2003）報道，胰島素短期刺激能增加Caco-2細胞攝取Gly-Ser的能力，但其上調作用與PepT1基因表達和質子驅動力無關。Meredith和Boyd（2000）早期關于胰島素調控肽轉運的報道表明，胰島素通過增加肽載體的數量刺激肽的吸收，這種數量的增加是胞漿池中轉運蛋白的轉移造成的。Thamotharan等（1999）試驗表明，在Caco-2細胞系培養基中添加生理濃度（5 nmol/L）的胰島素，培養1 h，能顯著增加小腸刷狀緣膜上二肽的轉運，其作用主要是通過胰島素與位于小腸基底膜上的受體結合，如果破壞胰島素與其受體的結合，胰島素的作用消失。從動力學參數進行分析，胰島素對PepT1轉運二肽 （Gly-Gln）的Km值沒有顯著影響，但Vmax提高2倍，表明胰島素不能提高PepT1對底物的轉運活性，但能提高刷狀緣膜上PepT1的濃度。膜上PepT1數量增加的機制表明，當破壞對重新合成PepT1轉運起重要作用的高爾基體，胰島素的作用仍然存在；進一步研究發現，胰島素處理對腸黏膜上PepT1基因水平沒有顯著影響，說明胰島素不能提高PepT1的合成，但如果破壞了對已合成PepT1轉運起重要作用的微管，胰島素的作用則消失。

3.2.2 甲狀腺激素對PepT1的調節 甲狀腺激素是由甲狀腺分泌的，維持動物正常的生長發育、正常的體溫和正常的能量水平，它的大多數作用是通過激活細胞核受體而進行調節的，導致mRNA和蛋白質合成的增加。Ashid等（2002）研究發現，T3會明顯減少Caco-2細胞對[14C]Gly-Sar吸收的Vmax，且不影響Km值，PepT1及PepT1 mRNA的水平下降，表明甲狀腺素抑制肽的轉運可能是降低PepT1 mRNA的轉錄水平或影響其穩定性。

3.2.3 瘦素對PepT1的調節 隨著瘦素的發現，對瘦素在肽吸收方面的調控作用也有了一些報道。Buyse等（2001）在Caco-2細胞系培養基中加入2 nmol/L瘦素，培養30 min，結果表明，瘦素能增加刷狀緣膜上Gly-Sar的轉運，對基底膜上二肽的轉運沒有影響；其PepT1轉運動力學參數Vmax上升，Km保持不變，同時增加細胞膜上PepT1含量，降低胞內PepT1含量，但PepT1 mRNA水平沒有改變。可見，瘦素對PepT1的調節機制和胰島素相同，都是通過增加PepT1從細胞質到小腸刷狀緣膜的轉運，而不是增加其mRNA的表達來對膜上PepT1水平進行調節。

3.2.4 表皮生長因子對PepT1的調節 表皮生長因子（EGF）刺激表皮細胞和其他多種上皮和非上皮細胞的增殖，調節胃腸道分化與發育。其主要有兩種不同的方式對PepT1進行調節，一種是長期作用，一種是短期作用。Nielsen等（2001）發現，EGF長期培養 （26～28 d）Caco-2細胞能夠降低Gly-Sar轉運量50%左右，Vmax降低90%，Km保持不變，同時PepT1mRNA表達水平和細胞膜PepT1蛋白表達量都明顯降低，表明EGF是通過下調PepT1基因表達降低細胞二肽轉運能力的。而Nielsen等（2003）的另一次研究發現，EGF刺激5 min即能增加Caco-2細胞攝取Gly-Ser的能力，并于10～20 min后達到平臺期，Vmax提高了50%左右，Km不變，但并未影響PepT1 mRNA豐度和H+濃度，同時其促轉運作用未受蛋白轉運抑制劑的影響，表明EGF處理不會影響PepT1蛋白的合成。

總的來說，短期調節激素主要是通過影響PepT1在細胞內和膜上的分布來調節膜上PepT1的濃度，而長期調節激素主要是通過影響PepT1 mRNA水平 （影響轉錄或其半衰期）來影響膜上PepT1的表達。

3.3 蛋白激酶C和環化腺苷酸對PepT1的調節在PepT1結構中有一個蛋白激酶C位點（PKC，Ser-3 5 7）和cAMP依賴性磷酸化位點（PKA，Thr-362）。 Brandsch 等（1994）報道，用佛波醇處理Caco-2激活蛋白激酶C（PKC）明顯抑制二肽轉運，該抑制作用是特異性的，可被蛋白激酶抑制劑staurosporine阻斷，其抑制作用與載體最大轉運速率減低有關，并不改變其親和力和質子驅動力，而蛋白質合成抑制劑放線菌酮對該效應無影響。Chen等（2002a）用staurosporine抑制PKC活性則明顯增加PepT1肽載體對[3H]-Gly-Sar的轉運，這種增加效應可被佛波醇12-豆蔻酸-13-醋酸酯（PMA、PKC激活劑）阻斷，蛋白質合成抑制劑放線菌酮對該效應也無影響。Muller等（1996）用霍亂毒素、腺苷酸環化酶激活劑、大腸桿菌內毒素、磷酸二酯酶抑制劑3-異丁基-1-甲基黃嘌呤處理細胞，提高Caco-2細胞內cAMP水平，抑制細胞對Gly-Sar的吸收，而霍亂毒素抑制作用也可被蛋白激酶抑制劑staurosporine、PKA抑制劑H-89和PKC抑制劑Chelerythrine所阻斷。

3.4 營養和飼養管理對PepT1的調節 研究發現，小腸體內和體外對二肽的吸收隨日糧蛋白水平和肽水平的提高而增加。Shiraga等（1999）用鼠作為動物模型就日糧中蛋白質水平對腸道中PepT1表達量的影響進行研究發現，50%酪蛋白組鼠腸道中PepT1 mRNA的表達量高于20%酪蛋白組，Gly-Phe二肽飼料組鼠腸道中PepT1 mRNA的表達量高于無蛋白質飼料組，但沒有達到顯著水平。Chen等（2005）研究了日糧蛋白質水平和限制飼喂對生長肉雞腸道中PepT1 mRNA表達量的影響發現，限制采食的3個處理中，腸道PepT1 mRNA表達量的高低與蛋白質水平呈正相關。 Erickson（1995）用低蛋白質日糧（4%）和高蛋白質日糧（50%）飼養大鼠，結果表明，飼喂高蛋白日糧組的大鼠，其小腸中段和末段增加的PepT1mRNA是低蛋白質日糧組的1.5～2倍。

在畜禽飼養中，短期缺食是很常見的。研究發現，饑餓也能通過增加PepT1 mRNA和蛋白表達水平，促進小肽的攝入。Ihara等（2000）通過對采食量的控制，研究大鼠在營養不良條件下，小腸PepT1基因表達作用，結果表明，短期缺食可使腸道中PepT1 mRNA和蛋白的表達上調。Ferraris等（1998）報道，無論是短暫的還是長時間的饑餓，都會增加PepT1 mRNA水平，從而增加小腸黏膜刷狀PepT1數量。從生理上講，饑餓使得小腸吸收面積減少，而靠增加小肽載體的數量來彌補。在營養不良條件下，體脂和糖原作為能量貯備而被利用，由于蛋白質是組織結構的組成部分和生物活性物質，在體內并沒有貯存庫，蛋白質的損失或缺乏將導致生理功能的迅速下降。因此，在營養不良條件下PepT1 mRNA表達上調可能是一種適應性機制。在日糧供給后，使機體能迅速吸收小肽，假如這種上調機制出現遲緩，那么必需營養物質通過小腸吸收效率將會大大降低，導致動物生產性能顯著下降。

3.5 其他 Pan等（2002）研究發現，晝夜節律也可影響肽轉運蛋白的表達和活性，小腸PepT1 mRNA豐度和轉運蛋白含量在 16∶00～24∶00比較高，在24∶00對[14C]Gly-Sar的吸收率顯著高于12∶00。 但 Pan 等（2001）在對小鼠實行白天飼喂時，發現小腸黏膜中PepT1的晝夜變化規律與自由采食完全相反?？梢?，是采食變化引起PepT1的晝夜變化而不是光照的作用。另有報道PepT1轉運活性與年齡有關，但各報道有所不一。Marion等（2001）研究表明，動物肥胖基因的產物Leptin可以使小肽轉運蛋白對小肽的轉運活性增強，表現為腸細胞內PepT1的含量減少，細胞膜上的含量增多，另外，體外吸收試驗表明，Leptin可明顯促進Caco-2細胞對二肽Gly-Sar的吸收。

4 研究PepT1的意義和存在的問題

小肽是日糧蛋白質在小腸中重要的消化產物。研究PepT1結構特點和調控方法，小肽在機體內消化吸收機理和轉運過程，對了解小肽生理功能及對機體進行合理供應都具有重要的生物學意義。

盡管人們對PepT1有了一定研究，但這些大多集中在對不同種類動物PepT1結構及分布上，缺乏系統研究參與PepT1 mRNA及其表達蛋白活性調節因素的作用機制、如何利用這些調節因素提高蛋白質轉運吸收以及小肽不同于游離氨基酸吸收利用的特點，而這些對于正確理解蛋白質營養、為動物配制平衡蛋白質日糧具有十分重要的理論和實踐意義。

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