不同形式的氮源對活體外瘤胃氨氮釋放和發(fā)酵參數(shù)的影響

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 辛杭書 張永根

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 孟慶翔＊

美國蘭科礦物質(zhì)公司 Dirk E A

國際原料公司 劉慶平

氨是瘤胃微生物生長發(fā)育所必需的物質(zhì)，而瘤胃中的氨來自于氨基酸的脫氨基和非蛋白氮（NPN）的降解。尿素作為一類含氮高、成本低、經(jīng)濟有效的非蛋白氮產(chǎn)品，被廣泛應(yīng)用于反芻動物生產(chǎn)中，但其降解過快（降解速度是微生物利用速度的4倍）及碳氮源發(fā)酵不同步是造成尿素利用率低的主要限制因素。所以，國內(nèi)外研究學(xué)者千方百計的探討如何達到尿素在瘤胃內(nèi)緩釋氨氮，或?qū)⒛蛩嘏c谷物淀粉（Helmer等，1970）、糖蜜等通過加壓加熱處理生產(chǎn)各種復(fù)合尿素產(chǎn)品（Madhu Mohini和Gupta，1993），或?qū)⒛蛩剡M行包被處理（Galo 等，2003；Tedeschi等，2002），但將這些產(chǎn)品應(yīng)用到實踐中，效果并不一致。

Helmer等（1970）率先提出糊化淀粉尿素中變性的淀粉組分更容易被細菌和原蟲利用，微生物蛋白產(chǎn)量比單用尿素與谷物混合飼喂時明顯提高。我國畜牧工作者也對糊化尿素制備及實踐應(yīng)用進行研究，取得了較滿意的效果（單達聰和熊六飛，2007；顧炳龍等，1996）。糊化淀粉尿素是在適合溫度（121～176℃）及壓力（28～35 kg/cm2或2744～3430 kPa）下，生成的淀粉與尿素的均勻混合物。而有學(xué)者提出，在顆粒料生產(chǎn)過程中的高溫高壓條件下，飼料原料中所含的尿素、胺鹽等含氮有機化合物有可能部分聚合為“三聚氰胺”類的化合物（林建云，2008）。然而，糊化淀粉尿素中是否有可能含“三聚氰胺”尚未見報道。本試驗選用普通尿素、糊化淀粉尿素、包被尿素（快速型和慢速型）和大豆分離蛋白，比較這五種不同形式氮源體外氨氮釋放速度，并分別測定“三聚氰胺”的含量，為在反芻動物生產(chǎn)中安全合理使用尿素提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 玉米采自河北凱特飼料廠，品種為當(dāng)?shù)赜衩?，用錘片式粉碎機粗粉碎（孔徑約為2 mm）后再用旋風(fēng)磨（1.0 mm）進一步細粉碎，置于塑料封口袋中供下一步組分分析及配料使用。普通尿素為化學(xué)純，糊化尿素為商品來源，蛋白質(zhì)含量為74.8%；兩種包被尿素均來自于美國Granco公司，以不能被瘤胃降解的聚氨基甲酸酯為包被材料，采用特殊的半透膜包被技術(shù)，主要成分含量為：尿素78%～96%，蠟質(zhì)0.3%～0.5%，色素0% ～0.11%。

1.2 樣品準(zhǔn)備及試驗設(shè)計 參考美國NRC肉牛營養(yǎng)需要，根據(jù)每種原料由氮素自動分析儀（Rapid N III，Elementar，Germany）測定的蛋白質(zhì)含量配制成蛋白質(zhì)含量為12.5%（干物質(zhì)基礎(chǔ)）的半純合等氮日糧，以玉米作為主要碳源底物，添加不同形式的氮源即普通尿素（負對照）、包被尿素（快速和慢速）、糊化淀粉尿素和大豆分離蛋白，采用單因子試驗設(shè)計，每種日糧設(shè)3個平行，整個試驗在不同天內(nèi)重復(fù)2次。

1.3 活體外發(fā)酵

1.3.1 活體外人工瘤胃產(chǎn)氣量測定 采用Menke等 （1979）的活體外產(chǎn)氣法進行體外試驗。將0.2 g（精確至0.0001 g）的不同日糧放入100 mL人工瘤胃培養(yǎng)管（德國H?berle公司，有效體積100 mL，最小分度1 mL）中，39℃預(yù)熱。于晨飼前通過瘤胃瘺管分別采集4頭試驗牛的瘤胃內(nèi)容物，等體積混合后，以4層紗布過濾，并迅速加入裝有經(jīng)CO2飽和并預(yù)熱39℃的緩沖液中，配制成混合培養(yǎng)液（瘤胃液與緩沖液配比為1∶2）。用自動加液器向各培養(yǎng)管加入30 mL混合培養(yǎng)液，迅速放入已預(yù)熱（39℃）的活體外人工瘤胃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一組培養(yǎng)管（三個）用于測定產(chǎn)氣量，分別記錄培養(yǎng) 1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、56、64 h 和 72 h 各培養(yǎng)管活塞的刻度值（mL）。

同時，將各組底物進行另一批次3個重復(fù)的培養(yǎng)，測定24 h底物干物質(zhì)的消化率。在39℃培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)管中內(nèi)容物全部倒入50 mL離心管中，5400 r/min離心15 min，沉淀烘干用于計算干物質(zhì)消化率。上清液用于測定pH、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）和NH3-N濃度等瘤胃發(fā)酵參數(shù)?；铙w外發(fā)酵試驗重復(fù)2次進行。

1.3.2 主要檢測指標(biāo)及分析方法 分別在0、1、2、4、6、8、12、18 h 和 24 h 取發(fā)酵液，離心后-20 ℃下冷凍，供NH3-N的測定，并測定24 h的VFA含量和干物質(zhì)消化率。pH值采用雷磁PHS-3C型精密pH計（數(shù)顯讀數(shù)精度0.01）發(fā)酵結(jié)束后迅速測定；NH3-N濃度測定采用 Broderick和 Kang（1980）的方法；VFA含量采用3420氣相色譜儀（北京分析儀器廠）進行分析。取1mL分離液相，加入0.2 mL 25%（m/V）偏磷酸搖勻后冰浴超過30 min，10000 g離心10 min，取上清液用于色譜分析。色譜條件：PEG-20M+H3PO4玻璃填充柱，色譜柱為內(nèi)徑3 mm、長2 m；載氣為氮氣，流速45 mL/min，氫氣流速35 mL/min，空氣流速250 mL/min，氫焰離子檢測器，柱溫150℃，離子化室溫度 220 ℃，靈敏度 107，衰減 4，進樣量 0.6 μL；干物質(zhì)測定采用國標(biāo)GB/T 6435-1986；三聚氰胺的測定采用農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1372-2007。

1.4 統(tǒng)計處理 采用SAS（1996）統(tǒng)計軟件進行兩因子方差分析，計算0.2000 g日糧干物質(zhì)活體外凈產(chǎn)氣量（72 h），并根據(jù)數(shù)學(xué)模型GP=B×[1-exp（-c × t）]，利用 SAS（1996）統(tǒng)計軟件中 NONLINEAR方法計算樣本的動態(tài)產(chǎn)氣參數(shù)，式中：GP為t時間點0.2000 g底物DM的產(chǎn)氣量，mL；B為0.2000 g底物DM的理論最大產(chǎn)氣量，mL；c為樣本產(chǎn)氣速度，h；t為活體外培養(yǎng)時間，h。

產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣參數(shù)、干物質(zhì)消化率及瘤胃發(fā)酵參數(shù)等各項檢測指標(biāo)均采用SAS統(tǒng)計分析軟件（SAS，1999）中的廣義線性模型（GLM）進行獨立樣本T檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同形式氮源對活體外瘤胃氨氮釋放動態(tài)的影響 表1列出了活體外發(fā)酵中含不同形式氮源的日糧0～24 h氨氮濃度變化的結(jié)果。從表中可以看出，不同形式氮源顯著影響0～12 h氨氮釋放速度（P＜0.05），其中兩種包被尿素的氨氮濃度在各時間點均低于其他處理組。從整體趨勢上看，所有處理組的氨態(tài)氮濃度在0～1 h上升，然后逐漸下降，在8 h（普通尿素組和糊化尿素組）或12 h（包被尿素組和大豆分離蛋白組）再次上升。糊化尿素組的氨態(tài)氮濃度均與普通尿素組相一致，未見顯著差異，前人的一些研究也發(fā)現(xiàn)將糊化尿素添加到動物飼糧中，并沒有明顯改善瘤胃中氨氮的釋放速度（Coppock等，1976），這可能與糊化尿素的制作原料的選用及生產(chǎn)方法不同有關(guān)。本試驗中，未見其能顯著減緩氨氮釋放速度，也可能是糊化尿素制作過程中對玉米的糊化程度不足所致。而對于兩種包被尿素，除在4 h時，快速釋放包被尿素的氨氮濃度顯著高于慢速釋放包被尿素外 （P＜0.0001），其余時間點均無明顯影響，并且與大豆分離蛋白組氨氮的釋放趨勢相似。

表1 不同形式氮源的活體外發(fā)酵氨氮濃度動態(tài)變化mg/100 mL

從表1可以看出，每種氮源處理日糧的氨氮濃度都先升高，再逐漸降到最低，然后再次上升，這可能是由于隨著飼糧的發(fā)酵和微生物的利用所導(dǎo)致氮素的不足，從而使瘤胃液中微生物自身發(fā)生分解所致。

本試驗中還分別對各種原料進行了“三聚氰胺”的測定，發(fā)現(xiàn)除了糊化尿素外，其他原料均未檢出。而糊化尿素中的“三聚氰胺”檢出量為24 mg/kg。林建云（2008）在探討“顆粒飼料與三聚氰胺”時提出，顆粒配合飼料的造粒過程中很有可能產(chǎn)生三聚氰胺類物質(zhì)，糊化尿素的生產(chǎn)同樣也是在高溫高壓下將谷物淀粉、尿素及其他一些緩釋劑混合糊化而成，與顆粒飼料的生產(chǎn)過程相似，所以很有可能是在糊化淀粉制作過程中促進了三聚氰胺的合成。但也有研究學(xué)者認為糊化淀粉的加工溫度為80～125℃，壓力為1.8～3.0 MPa，溫度不夠，沒有催化劑，與三聚氰胺生產(chǎn)所需的條件不相吻合，不具備產(chǎn)生三聚氰胺的化學(xué)反應(yīng)條件（李勝利，2008）。 林祥梅等（2008）采用灌胃方式給予小鼠三聚氰胺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加三聚氰胺飼喂小鼠的全部不致死的最大劑量是5000 mg/kg。而本試驗中糊化淀粉中三聚氰胺的含量遠未達到此劑量，但對于糊化淀粉過程是否能產(chǎn)生三聚氰胺類化合物及其在飼料原料中使用安全性的機理性研究還尚未見報道，仍有待進一步探討。

2.2 含不同形式氮源日糧對活體外發(fā)酵動態(tài)產(chǎn)氣參數(shù)和發(fā)酵參數(shù)的影響 見表2。由表2顯示，普通尿素組的72 h產(chǎn)氣量在數(shù)值上比其他處理組低1.65～2.86 mL，但統(tǒng)計上差異并不顯著（P>0.05），同樣，產(chǎn)氣速度、pH及24 h干物質(zhì)消化率也未見明顯變化。日糧發(fā)酵后的產(chǎn)氣量及揮發(fā)酸總量主要與其中的碳水化合物含量有密切相關(guān)，五種處理日糧均以玉米為主要碳源，所以其產(chǎn)氣量和總揮發(fā)酸含量均未見顯著性差異。而對于各種揮發(fā)酸的摩爾比例，不同氮源顯著影響發(fā)酵液中戊酸的含量，其中大豆分離蛋白組具有最高的戊酸含量 （1.34 mmol/100 mol總揮發(fā)性脂肪酸），包被緩釋尿素 （慢速）組的戊酸含量最低（1.13 mmol/100 mol總揮發(fā)性脂肪酸），其他處理組居中。戊酸是瘤胃發(fā)酵過程中碳水化合物及氨基酸代謝的終產(chǎn)物，主要是賴氨酸和精氨酸這兩種氨基酸的代謝，而有研究顯示（張澤生等，2007），大豆分離蛋白中的賴氨酸和精氨酸的含量分別為47.9 mg/g和61.7 mg/g，而糊化尿素和包被緩釋尿素幾乎不含有氨基酸，這可能造成大豆分離蛋白組戊酸含量高的原因之一。

表2 不同形式氮源日糧活體外產(chǎn)氣動態(tài)參數(shù)及發(fā)酵參數(shù)

3 結(jié)論

不同形式的氮源顯著影響活體外瘤胃氨氮釋放速度，兩種包被尿素顯著降低了瘤胃氨氮釋放，與大豆分離蛋白相似，除在4 h時，快速釋放包被尿素的氨氮濃度顯著高于慢速釋放包被尿素外，其余時間點均未見二者有顯著的不同；糊化淀粉尿素并沒有減緩氨氮的釋放，并檢測出其含有三聚氰胺，雖然其含量較低，但對其產(chǎn)生的機理及將其作為原料添加在動物飼糧中的安全性研究還有待進一步研究。

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