實驗動物與人獸共患傳染病

夏咸柱，高玉偉，王化磊

（軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，長春 130122）

1 人獸共患傳染病的形勢嚴峻

人獸共患病是指在脊椎動物與人類之間自然傳播的疾病和感染，即脊椎動物和人類由共同病原體引起的，在流行病學上有相互關聯的疾病。在WHO所分類的1415種人類疾病中，有61％屬于人獸共患病。在人類所知的300多種傳染病中，除十余種只感染人類之外，其余的都是人獸共患傳染病。近年發生的175種新發傳染病中，有132種是人獸共患傳染病，占75.4％。人獸共患傳染病曾給人類造成了巨大的危害。1333年黑死病（鼠疫）肆虐，僅在歐洲就造成2000萬人死亡；1918年的“西班牙流感”在不到一年的時間內傳遍世界，導致5000萬人死亡；1957年“亞洲流感”導致100萬人死亡；1981年發現首例AIDS病人，目前在全球已造成3000萬人死亡；2003年30余個國家和地區暴發SARS，導致8437人發病，813人死亡；2003年再度發生的人禽流感導致564人發病，330人死亡（截止2011年8月9日），病死率近60％。

當前人獸共患傳染病的防控形勢十分嚴峻。一方面，新發與烈性人獸共患傳染病如SARS、禽流感、甲型H1N1流感、病毒性出血熱等疫情不期而至，近年來幾乎每1～2年就會出現一種全球性流行的新發傳染病。另一方面，曾經嚴重威脅人類健康的炭疽、鼠疫、狂犬病、結核病、布魯氏桿菌病等時有死灰復燃。如何有效預防、控制和消滅人獸共患傳染病已成全人類面臨的巨大挑戰。

2 實驗動物是人獸共患傳染病防控重要支撐條件

實驗動物是指以科學實驗為目的，經人工飼養、繁殖，對其攜帶的微生物或寄生蟲進行控制，遺傳背景明確、來源清楚，而應用于科學研究、教學、生產和鑒定以及其他科學試驗的動物。人們預測以生命科學為基礎的第六次科技革命將來臨，而實驗動物是生命科學研究的基礎和重要支撐條件。生命科學的支撐條件可概括為AEIR要素：animal（實驗動物）；equipment（儀器設備）；information（信息）；reagent（試劑）。實驗動物居于生命科學研究四大支撐條件之首，足見其在生命科學研究中的重要性。很多重要的科研成果來源于實驗動物，實驗動物起著“活的天平”和“活的化學試劑”的作用。實驗動物已被廣泛用于科學研究的各個領域，尤其在生物醫學研究中更是非常重要的支撐條件。同樣實驗動物也是人獸共患傳染病研究的重要支撐條件。

3 實驗動物在人獸共患傳染病防控研究中的應用

作為支撐條件的實驗動物在人獸共患病防控研究中應用頗為廣泛，包括病原分離、感染與發病機制研究、藥物篩選與評價、疫苗研制與評價、診斷用品制備等諸多方面。人獸共患傳染病種類較多，病原體復雜多樣，需要有針對性的開展防控研究。我國農業部在2009年1月19日會同衛生部發布了《人獸共患傳染病名錄》。名錄包含26種傳染病，其中收錄了3種病毒性傳染病，為高致病性禽流感、狂犬病和豬乙型腦炎。本文重點介紹實驗動物在流感和狂犬病防控研究中的應用。

3.1 實驗動物在A型流感防控研究中的應用

A型流感病毒包括16個血凝素亞型（HA）和9個神經氨酸酸酶亞型（NA），理論上可以組合成144種A型流感病毒。A型流感病毒的自然宿主是水禽和家禽。所有亞型都可以感染水禽。A型流感病毒中的三種HA亞型（H1，H2，H3）和兩種NA亞型（N1，N2）上世紀已經廣泛引起人感染，這些在人群間常規流行的流感稱之為季節性流感。在美國，季節性流感每年可造成2～3萬人死亡。HA決定了A型流感病毒的抗原性，新抗原性流感病毒的出現會導致流感大流行的發生。例如1918 H1N1亞型“西班牙流感”導致了全世界2000～5000萬人死亡，2009年的A/H1N1流感在不到3個月的時間內形成全球大流行。禽流感病毒中的H5，H7和H9亞型已經從禽類跨種傳播到包括豬、馬和人在內的多種哺乳動物中。過去的研究中禽流感感染人或人流感感染鴨都表明其具有種間特異性，流感病毒不能很好復制。盡管如此，越來越多的自然感染事件表明流感病毒能夠跨越種間屏障。例如，馬流感H3N8能夠傳染狗，禽流感可以傳染豬和人。2003以來，高致病性H5N1禽流感以造成546人感染，330人死亡，并且這些感染病例中大多是從感染的禽類直接傳染給人的。A型流感的復雜性和不斷大流行促使人們要不斷的對流感的傳播機制、致病機制和防治開展深入的研究。

3.1.1 實驗動物在A型流感病毒在哺乳動物間水平傳播機制研究中的應用

雪貂和豚鼠被廣泛用于A型流感病毒在哺乳動物間水平傳播機制研究。1930年，人們首次將雪貂用于流感病毒分離。自然狀態下，雪貂對流感病毒十分敏感并且呈現與人相似的臨床癥狀（如噴嚏，流鼻涕，體溫升高等）。研究表明雪貂的上呼吸道受體與人相似，因此雪貂適用于評價A型流感病毒在哺乳動物間的傳播能力。在1941年，研究人員首次用雪貂模型研究流感病毒的傳播，發現感染的雪貂可以進一步感染同群健康雪貂，甚至當用物理屏障阻隔飛沫后還可以發生傳播。后來很多學者都選擇雪貂作為研究流感病毒傳播的哺乳動物模型。但由于雪貂對多種病原敏感、價格較貴并且飼養條件要求高，一定程度上限制了流感病毒傳播機制的研究。人們把目光轉向了小鼠，盡管品系較純的小鼠已經廣泛用于流感病毒致病力的研究，但僅L.SCHULMAN等證明感染流感的小鼠可以傳染同群的健康小鼠［1］。隨后多位研究者證明絕大多數流感病毒都不能在小鼠中傳播，甚至1918 H1N1也未能引起傳播。因此，小鼠不適宜作為研究流感傳播的模型。研究人員發現豚鼠像雪貂一樣對人流感病毒和禽流感病毒都敏感，他還進一步研究證明豚鼠適合研究流感病毒的傳播。人流感病毒在豚鼠中可以高效傳播（包括接觸性傳播和非接觸性傳播）。體積較小、價格低廉的豚鼠成為研究流感病毒傳播又一個重要的哺乳動物模型，但和雪貂不同，感染的豚鼠臨床癥狀并不明顯，即不易通過病理改變區分接觸的豚鼠感染與否。

為探討H5N1亞型流感病毒在哺乳動物間水平傳播的能力和分子機制，我們應用豚鼠作為哺乳動物模型，評價了5株H5N1亞型鴨源和1株候鳥源病毒的復制和水平傳播能力。結果其中兩株病毒A/duck/GX/35/01（DKGX/35）和A/Bar-Head Goose/03/2005能夠在豚鼠間水平傳播。應用一系列的拯救突變病毒進行傳播實驗，發現PB2基因701Asn（N）是DKGX/35水平傳播的一個必要條件。另一個決定DKGX/35傳播能力的條件是病毒的受體結合特性。DKGX/35同時識別SAα2，3Gal、SAα2，6Gal和長型（傘型拓撲結構）SAα2，6Gal受體。血凝素（HA）Q226L和G226S的雙突變可使病毒只具有SAα2，6Gal受體結合特性，且此突變病毒可在豚鼠間水平傳播。HA的160位氨基酸由Ala（A）變成Thr（T）時，35/HA-A160T完全轉變為SAα 2，3Gal受體結合特性，該變化導致病毒不能在豚鼠間水平傳播。A160T變異可導致HA增加一個糖基化位點，從而影響了病毒受體結合特性。該研究表明H5N1亞型流感病毒的PB2基因與HA基因是決定病毒能否在哺乳動物間傳播的關鍵基因［2］。

家禽（雞、鵪鶉）和豬是流感病毒的中間宿主，流感在這些動物體內病毒重組和宿主適應可能會發生，利用這些動物作為動物模型可以更好的理解宿主適應和流感病毒傳播給人類的分子機制。近來，貓和狗已被用作流感病毒感染的模型。貓暴露于家禽或者野鳥間自然感染H5N1流感病毒的病例已有報告，并且H5N1流感病毒可以在貓之間傳播。我們在H5N1病毒感染虎的研究中發現尚在哺乳期的小虎也可發生感染，說明H5N1病毒可能氣源途徑傳播。在2004年佛羅里達州發現馬的H3N8流感病毒在狗群間傳播，在韓國也有發生狗自然感染H3N2流感病毒的病例。人類經常與貓和狗在一起使得研究這些動物對流感病毒的傳播性受到人們的關注。

3.1.2 實驗動物在A型流感病毒重配研究中的應用

近年來關于流感病毒重配的研究與報道正逐步成為熱點，重配流感病毒對人類構成很大的威脅。歷史性的1957年和1968年的大流行的流感病毒被認為是禽流感和人類流感病毒的重配病毒，目前2009年的甲流大流行被認為是禽流感、豬和人類病毒的重配病毒。流感病毒經常在各種生物環境下循環，然后進入不同的動物體內，衍生出各類流感病毒。應該警惕甲流和禽流感發生重配變異，若這種現象發生，對人類的影響將是災難性的。研究人員已通過應用實驗動物體內重組的方式或應用反向遺傳操作技術人為重配的方式對A型流感病毒的重配機制開展了一系列的研究。Sara Jackson等人將高致病性低傳播性的禽H5N1、低致病性高傳播性的人H3N2在雪貂體內重配，分離純化出5株含有H5N1HA基因的重配病毒［3］。這些結果說明重配病毒能夠在體內發生，這兩種亞型的流感病毒的重配更易發生在雪貂的上呼吸道。這也很容易的推斷出人季節性流感病毒與禽H5N1流感病毒持續暴露，能增加H5亞型重配病毒的可能性及風險。所以在高致病性高傳播性的重配病毒出現之前這些研究就很有必要的，檢測仍然是公共安全衛生的重要措施，以盡量減少這種重配的大流行毒株出現的風險。Chen LM和Chengjun Li等人分別利用反向遺傳操作研究禽H5N1、人H3N2進行體外重配病毒，重組病毒的表面基因HA、NA來自禽H5N1，其余六條片段隨機組合。近一半的重配病毒在體外顯示高效率復制，揭示了禽流感病毒和人流感病毒各基因之間的高度兼容性。研究結果突出監測的重要性，尤其是監測含有人流感病毒PB2段的H5病毒的重配病毒。Sun Y等人利用反向遺傳的方法將禽H9N2和甲流H1N1體外重配，其中重配病毒的PA基因來自甲流H1N1。結果顯示這些重配病毒有著很高的兼容性且一半以上的重配病毒在體外能高滴度復制。所有的結果提示我們H9亞型的重配流感病毒尤其是含有H1N1/2009起源的PA基因重配病毒的出現對人類有更高的潛在威脅，H1N1 PA基因的重配病毒具有很高的公共安全衛生風險。J.Brian Kimble等人利用反向遺傳的方法將禽H9N2與甲流H1N1進行體外重配，并評估了4株重組病毒在雪貂模型中傳播特性，結果證明禽流感病毒H9N2的表面基因與H1N1病毒的內部基因能通過飛沫在雪貂間有效地傳播。重配病毒在H1N1病毒的背景下包含H9N2的HA基因或者也包含H9N2的NA基因，產生的4株病毒有3株能有效的進行飛沫傳播。但4株病毒存在復制效率上的差異。結果清楚地表明，禽流感病毒H9N2和H1N1病毒都可以偶爾感染豬，他們有產生感染哺乳動物的的新型重組病毒的潛力。Ca’ssio Pontes Octaviani等人在細胞MDCK-M2內共感染豬H1N1、禽H5N1病毒，并發現這兩種病毒有很高的遺傳兼容性，有些重配病毒比母本病毒有更好的生長動力［4］。從而推出這兩株病毒之間的重組可以發生，可能會造成H5N1重配病毒的大流行。應用適宜的動物模型評價流感病毒株之間的重配機制及重配病毒的生物學特性對流感大流行的預警和預測具有重要作用。

3.1.3 實驗動物在A型流感病毒致病與救治研究中的應用

3.1.3.1 小鼠

在流感病毒致病性研究中，小鼠是最常用的實驗動物。季節性流感病毒一般都不能有效的在小鼠體內復制，病毒在小鼠體內連續傳代后可表現出復制能力和致病性增強。Puerto Rico/8/34，WSN/33和FM/1/47等季節性流感病毒在小鼠體內適應后會表現出對小鼠的高致病性，這些毒株稱之為鼠肺適應株。HA（G218E）和NS1（D125G）氨基酸的突變與病毒的致病性增強相關。2009年出現的新型甲型H1N1流感病毒不需要適應就可感染小鼠，但同樣表現出較低的致病性。我們在研究中發現A/Jilin/XD/2009在小鼠體內經18代的適應性傳代后，病毒的致病性和抗原性均發生改變，進一步分析發現PB2、PB1、PA、HA和NP上氨基酸發生了變異。高致病性禽流感病毒和1918年西班牙流感病毒無需經過傳代適應就能夠在小鼠上引起嚴重的疾病。它們可以在小鼠肺部以外的組織中進行復制，并引起高死亡率。高致病性流感病毒聚合酶基因上的突變，例如PB2-E627K突變和PB1-F2蛋白的N66S突變，這些突變已經被證明參與損傷適應性免疫應答和介導宿主細胞凋亡，這些突變有助于增強病毒的復制和多器官感染。人感染高致病性禽流感病毒和1918西班牙流感病毒后表現出嚴重的肺部病理變化，包括肺水腫和大量炎性浸潤。比起感染低致病性流感病毒，感染這些病毒可以導致肺部的巨噬細胞和中性粒細胞的數量顯著增加，表明這些細胞在急性肺損傷扮演重要的角色。一些H5N1亞型高致病性禽流感病毒對小鼠是致死的，然而其它的則不是。小鼠感染無致死力的H5N1亞型流感病毒后只會出現短暫的淋巴細胞減少，然而當小鼠感染H5N1亞型高致病性禽流感病毒后則表現出嚴重的淋巴細胞減少癥。小鼠感染致死性的H5N1亞型流感病毒后，肺臟和淋巴樣組織中的CD4+和CD8+T細胞以及白細胞介素1β、干擾素γ和趨化因子巨噬細胞炎性蛋白質的合成均減少。相反，感染小鼠腦中的趨化因子和細胞因子的水平上升，另外有證據表明感染小鼠的脾臟和肺臟中出現細胞凋亡，這些研究結果表明一個淋巴細胞破壞機制［5］。H5N1亞型流感病毒對免疫系統的破壞效果也許有助于提高該病毒對哺乳動物的毒力。

3.1.3.2 雪貂

季節性人類流感病毒通常對雪貂有輕度或中度的致病性［6］。雪貂感染的臨床癥狀與人很相似，包括嗜睡，流鼻涕，打噴嚏，發燒，體重減輕。這些臨床癥狀的嚴重程度取決于流感病毒的毒株。流感毒株造成雪貂輕微的疾病與肺部輕度炎癥改變相關。雪貂感染高致病性病毒如H5N1亞型禽流感病毒和1918“西班牙流感”病毒表現出嚴重的癥狀，有可能引起致死。H5N1病毒能夠在雪貂的腦、脾、腸復制，而1918年流感病毒已經從雪貂的心臟和脾臟分離到。一些數據表明H5N1病毒在雪貂和小鼠體內具有嗜神經性。

3.1.3.3 非人靈長類動物

一般非人類靈長類動物對流感病毒的易感性比人類要弱，可檢測到病毒的復制但動物不發病。一般來說，高劑量的病毒通過多種途徑注射來保證動物感染流感病毒。比如，恒河猴和短尾猴只有通過氣管感染和鼻內感染H1N1流感病毒時表現臨床癥狀。短尾猴通過氣管感染H3N2流感病毒不表現臨床癥狀，盡管可以從鼻拭子和肺灌洗液中分離出病毒。相反，短尾猴感染季節性H1N1病毒產生疾病的臨床癥狀，包括體重減輕、流涕、發熱以及與人類相似的肺臟的病理變化。疾病在非人靈長類也可以進展表現出特殊的疾病癥狀，比如感染低毒力病毒后表現出的結膜炎和鼻液溢。其它流感病毒株，比如高致病力禽流感、1918年流感和2009年H1N1流感病毒在非人靈長動物體內復制并引起輕度到重度的疾病。1919年流感病毒對短尾猴具有強致病性，可以引起急性呼吸窘迫并致死。1918年流感病毒呈現復制能力和組織嗜性不同于同期的人流感。對于非人靈長類動物可以在感染后持續8天在上呼吸道和下呼吸道檢測到1918年流感病毒，而季節性流感病毒僅限制于上呼吸道，一般在感染后6天就被清除。短尾猴和恒河猴同時也被用于研究高致病性H5N1流感病毒發病機制的動物模型。這些猴子表現出與人類相似的系統性癥狀，包括發熱、疲倦、食欲下降，但呼吸系統相關癥狀不明顯［7，8］。

3.1.4 實驗動物在A型流感病毒靶向藥物研究中的應用

在流感的救治研究中，最常用的動物模型同樣是小鼠。我們以小鼠為模型，開展了靶向藥物的研究。我們以禽流感病毒單鏈抗體作為靶向部分，以特異性抗禽流感病毒的反義核酸為殺傷感染細胞的效用部分，開展了靶向抗流感病毒藥物研究。小鼠體內的攻毒保護試驗顯示針對PA基因的PA492和針對NP基因的NP628反義核酸均能保護部分小鼠免受致死劑量H5N1禽流感病毒的攻擊，保護率分別為50％和37.5％；同時PA492也能有效地保護小鼠免受致死劑量甲型H1N1流感病毒的攻擊，保護率達80％；進一步不同時間感染小鼠的體內肺病毒滴度和肺感染指數試驗結果也顯示PA492和NP628能抑制H5N1或H1N1流感病毒在小鼠體內的復制。禽流感病毒的血凝素抗原（HA）在感染細胞表面大量存在，能夠在抗病毒靶向性治療中作為特異性抗體的靶標。我們將禽流感病毒HA特異性的scFv基因和截短的人魚精蛋白基因通過連接子（linker）結合，將獲得的融合蛋白進行原核表達、純化和復性，能夠從1L細菌培養物中獲得約6mg、純度約為90％的融合蛋白，復性率約為5％。細胞ELISA和間接免疫熒光試驗顯示融合蛋白對HA具有和單獨單鏈抗體相似的識別和結合活性，以劑量依賴性方式和HA結合。EMSA試驗顯示融合蛋白能夠有效結合DNA。流式細胞儀檢測顯示融合蛋白能介導含EGFP質粒和FITC標記的寡核苷酸特異性的傳遞到病毒感染的細胞表面。在融合蛋白結合反義核酸的實驗中，通過病毒滴度、熒光定量PCR和間接免疫熒光試驗顯示融合蛋白能夠提高PA492在MDCK細胞上的抗病毒活性，體內傳遞試驗顯示融合蛋白能夠介導FITC標記的PA492進入禽流感病毒感染的小鼠肺部組織，小鼠體內的攻毒保護試驗顯示融合蛋白介導的PA492能夠部分保護小鼠免受致死劑量H5N1流感病毒的攻擊，保護率達62.5％，效果稍好于脂質體的介導（50％存活率）。此外，融合蛋白介導的PA492和脂質體介導的藥物相比在感染小鼠體內有更低的肺感染指數和肺病毒滴度［9，10］。

3.2 實驗動物在狂犬病防控研究中的應用

狂犬病（Rabies）俗稱瘋狗病，又名恐水癥，是一種侵害中樞神經系統的急性人獸共患傳染病，所有溫血動物包括人類，均能被感染。野生動物是該病的主要貯存宿主，不同動物對狂犬病的敏感性差異大，其中患狂犬病的犬是人感染狂犬病的主要傳染源。用于狂犬病研究的實驗動物主要包括：小鼠、家兔、豚鼠及非人靈長類（恒河猴）等，實驗動物廣泛應用于狂犬病病原學、發病機制、疫苗及免疫學等各個研究領域。

3.2.1 實驗動物在狂犬病病原診斷學研究中的應用

通過接種動物或細胞分離培養病毒是最常用的病毒確診方法。病毒分離后才能對其進行進一步傳代，并通過抗原或遺傳進化分析進行特性鑒定。乳鼠腦內接種試驗是目前最常用的狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）分離方法，該方法敏感、可靠。本課題組近幾年來通過乳鼠腦內接種試驗已經分離到15株狂犬病病毒街毒株，并對其全基因組核苷酸序列進行了測定分析，結果發現我國的流行性街毒株均為基因I型，形成2個進化群，進化I群與中國犬源街毒株BD06進化關系極其相近，II群與人源街毒株HN10同在一個進化分支。小鼠腦內中和試驗是最早被采用的狂犬病病毒抗體檢測方法，以小鼠或乳鼠測定病毒-血清感作后殘存的病毒感染力。但由于此法操作繁瑣，目前已基本被細胞水平的中和試驗所代替。

3.2.2 實驗動物在狂犬病致病機制研究中的應用

目前對于狂犬病的發病機制尚不完全明確，狂犬病實驗動物人工感染模型的建立對于認識狂犬病的自然發病機制具有重要借鑒意義。狂犬病病毒具有嚴格的嗜神經性，病毒自咬傷部位入侵后，通過神經-肌肉接頭或神經傳感器侵入外周神經，再延脊髓到達中樞神經系統（central nervous system，CNS），病毒在CNS進行大量增殖后離心傳播至外周神經系統。人或動物自然感染狂犬病通常具有較長的潛伏期，且時間長短不一。目前尚不完全明確狂犬病病毒自感染部位進入中樞神經系統之前是否在局部進行增殖，Murphy等以病毒感染新生地鼠的實驗研究表明：病毒可在接種部位的橫紋肌內增殖［11］。因此病毒感染和增殖的局部可能是狂犬病病毒長時間隱蔽的場所，Fekadu及Chaltron分別以犬和臭鼬證明了此實驗結果。與上述結果不同，Shandkar以病毒人工感染小鼠咬肌后發現：病毒進入肌肉組織后不在局部復制而是直接侵犯中樞神經系統。狂犬病病毒一旦進入外周傳入神經纖維之后，便在神經細胞內向心性運行。分別以狂犬病病毒固定毒株及街毒株感染小鼠模型的試驗表明：固定毒株向心性運行速度為3.0mm/h，而街毒株的運行速度要比固定毒株慢的多。Dean等將相同劑量的狂犬病病毒Flury LEP分別接種狐貍頸部和腿部肌肉，結果發現與腿部肌肉注射相比，頸部注射試驗動物潛伏期短、發病快及死亡率高。狂犬病病毒在腦內大量增殖后，一方面引起神經系統癥狀，一方面通過在傳出性運動神經、感覺神經和自主神經系統中運行到達所支配的組織和器官，導致非神經組織的感染。狂犬病病毒隨著腺體細胞的分泌進入唾液內，進而通過唾液傳播至其它動物或人。實驗動物感染試驗表明：感染動物唾液腺的感染性高低與實驗動物種類密切相關，如犬、貓的感染性高（74％～88％），而奶牛的感染性則較低（47％）。

研究表明：乙酰膽堿受體（AchR）、神經細胞黏附分子（NCAM）及神經生長因子受體（p75NTR）可能是介導狂犬病病毒感染機體的受體。但NCAM及p75NTR基因缺失小鼠仍可感染狂犬病病毒的試驗表明：狂犬病病毒的真正受體有待進一步研究［12，13］。

3.2.3 實驗動物在狂犬病疫苗研究中的應用

預防與控制狂犬病有兩大手段：一是動物的免疫。眾所周知，患病動物是人狂犬病的傳染源，有效地預防動物狂犬病的流行，是控制人狂犬病發生的根本。日本、美國和西歐等多數發達國家通過預防和控制動物的狂犬病，已經基本甚至完全消除了人的狂犬病。其二是人的免疫與治療。人的免疫分為暴露前和暴露后免疫，暴露前免疫是給經常與狂犬病病毒或動物接觸的人接種疫苗，暴露后免疫是給被患狂犬病動物或者疑似狂犬病動物咬、舔、抓傷的人及時接種疫苗及抗狂犬病免疫球蛋白。因此，安全、高效的狂犬病疫苗是控制狂犬病的基礎。目前，人用狂犬病疫苗主要為滅活、純化的細胞培養疫苗，該疫苗具有安全、高效等優點，已被廣泛用于人狂犬病的暴露前及暴露后預防免疫。在疫苗制備過程中的安全性檢測、效價評價（NIH效力測定）等均以小鼠為動物模型進行。當前狂犬病疫苗的研發主要集中于流浪犬、貓及野生動物用口服疫苗。Kiney等構建了痘苗-狂犬病病毒糖蛋白（VRG）重組病毒，該疫苗可在小鼠模型誘導產生高水平的狂犬病病毒中和抗體，并能抵抗致死性強毒攻擊。目前該疫苗已在美國取得生產許可并廣泛用于野生動物的免疫。Schnell等利用反向遺傳技術構建了表達2個糖蛋白及3個糖蛋白的重組狂犬疫苗，傅振芳等構建了表達先天性免疫刺激因子的重組病毒［14］，在小鼠動物模型中，此類疫苗不僅對狂犬病具有良好的暴露前免疫預防效果，且具有顯著的暴露后治療效果。本實驗室近年來也建立了狂犬病病毒ERA、CVS-11、SRV9株的反向遺傳操作系統，并以此為基礎構建了G蛋白突變株狂犬病病毒（rRVG*），該病毒對乳鼠的致病力明顯降低，對成年鼠無致病性，同時可在犬體內誘導良好的免疫反應。

3.2.4 實驗動物在狂犬病免疫研究中的應用

3.2.4.1 保護性免疫應答

狂犬病病毒固定毒株感染刺激機體產生的抗病毒免疫應答可有效阻止狂犬病的發生，說明狂犬病病毒街毒株的致病性取決于病毒在CNS中傳遞卻不引起保護性免疫應答的能力。Kaplan及Hooper等以不同病毒毒株感染小鼠后發現，病毒的免疫原性與其糖蛋白的表達成正相關，因此病毒自身結構蛋白表達量可顯著影響抗病毒免疫應答的誘導。Morimoto等分別以表達低水平糖蛋白的高致病性病毒株CVS-N2c及表達高水平糖蛋白的低致病性病毒株CVS-B2c感染正常小鼠，結果發現，CVS-N2c感染過程中由于糖蛋白表達水平低，誘導神經元凋亡能力也降低，免疫原性弱，因此高致病性狂犬病病毒株感染過程中T細胞功能及中和抗體水平均降低。與高致病性狂犬病病毒相比，低致病性病毒感染小鼠后可在腦內誘導高水平的MHC-2分子表達。此外，狂犬病病毒感染可下調細胞介導的免疫功能。Camelo等以TNF-α p55受體基因缺失小鼠為模型研究發現，與正常小鼠相比，TNF-α p55受體基因缺失小鼠感染高神經嗜性的狂犬病病毒CVS11后出現低水平的免疫抑制，因此TNF-α p55受體依賴通路可能參與此機制［15］。

病毒入侵機體后，會誘導機體產生一系列的免疫應答過程，包括先天性免疫和獲得性免疫反應。狂犬病暴露后不一定能發病，可能因為病毒沒有成功引起感染，或雖引起感染但卻被機體產生的免疫反應控制在早期階段。Fu等以小鼠為模型研究發現，狂犬病病毒致弱毒株可激活機體的先天性免疫應答，尤其是IFN-α/β信號通路［16］。狂犬病病毒致弱毒株感染后，若干IFN介導的信號通路和細胞轉錄活化過程中所參與的基因均發生上調，主要包括干擾素信號通路基因（Stat 1、2、3和Jak-2）和干擾素調節因子（IRF-1、2、7）。除IFN-α/β通路外，狂犬病病毒致弱毒株可同時刺激其它先天性免疫分子的表達，如細胞因子、趨化因子、TLRs及補體成分等。先天性免疫分子表達的增多，可進一步引起中樞神經系統炎癥反應及炎性細胞浸潤。Zhao等以反向遺傳技術構建了表達MIP-1α、RANTES及IP-10等先天性免疫分子的重組狂犬病病毒，以小鼠為動物模型研究發現，表達MIP-1α的重組病毒通過誘導短暫的先天性免疫應答而進一步降低病毒的致病性。然而表達RANTES及IP-10的重組病毒因持續誘導高水平的趨化因子表達，中樞神經系統炎性細胞浸潤及血腦屏障通透性的變化而增強了病毒致病性。此外，先天性免疫分子的表達還可通過聚集、激活樹突狀細胞及B淋巴細胞增強病毒的適應性免疫應答。Wen等將構建的表達MIP-1α及樹突狀細胞刺激分子的重組病毒通過肌肉注射免疫小鼠，與母本病毒相比，重組病毒可誘導機體產生更高水平的狂犬病病毒中和抗體，并保護更多的小鼠免受強毒攻擊。Wang等以小鼠為動物模型，研究表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）的重組病毒在狂犬病暴露后治療中的作用。結果發現：即使在暴露后第5天，重組病毒仍然具有良好的暴露后治療作用，此新型疫苗不僅可用于狂犬病的暴露前及暴露后預防，還可能用于狂犬病的臨床治療。其保護機制可能為：重組病毒在中樞神經系統中誘導的先天性免疫分子表達及炎性細胞浸潤不僅可清除病毒感染細胞，將感染控制在早期階段，還可增強血腦屏障通透性，進而使外周產生的抗體分子或B淋巴細胞得以進入中樞神經系統而進一步清除病毒感染細胞。Hooper等以RABV致弱毒株感染小鼠后發現，可從CNS清除病毒的正常小鼠CNS內存在B淋巴細胞（CD19）和λ輕鏈mRNAs，并可檢測到狂犬病病毒中和抗體，從CNS分離的B細胞經體外培養后也能產生RABV特異性抗體。因此，CNS中的特異性抗體可能是由滲入的B淋巴細胞產生，而不是外周循環抗體滲入。

病毒感染或自身免疫誘導產生的CNS炎癥反應中，血腦屏障完整性的喪失通常可引起嚴重的神經癥狀。Hooper等發現狂犬病病毒致弱毒株CVSF3在小鼠腦內的清除是個例外，病毒清除過程中伴隨血腦屏障通透性的增加及CNS炎癥反應，而沒有出現神經病理學變化。通常認為TNF-α與血腦屏障通透性的增加密切相關，Phares等以TNF-α（TNF-/-）、B細胞（JHD-/-）、T細胞及B細胞（RAG-2-/-）基因缺失小鼠為模型研究發現：狂犬病病毒感染中CNS內TNF-α的表達與血腦屏障通透性的變化無關，CD4+T細胞而不是CD8+T細胞或B細胞為增強血腦屏障通透性所必需。Roy等分別以實驗室致弱毒株和街毒株感染小鼠后發現，街毒株也在外周刺激機體產生高水平的免疫應答，而CNS內浸潤的免疫炎性細胞卻很少。因此，街毒株感染的高致死率與不能增強血腦屏障的通透性及不能輸送病毒特異性免疫效應因子進入CNS有關［17］。PLSJL小鼠具有較低的下丘腦-垂體-腎上腺軸活性，卻可介導高水平的CNS炎性反應。Roy等以狂犬病病毒SHBRV株分別感染PLSJL及129/SvEv小鼠，50％的PLSJL小鼠可抵御SHBRV感染，而所有的129/SvEv小鼠均死于狂犬病感染。進一步研究發現，兩類小鼠對狂犬病病毒感染的敏感性差異主要取決于PLSJL小鼠可增強血腦屏障通透性［18］。因此，設法使外周產生的免疫效應因子通過血腦屏障進入CNS是感染狂犬病病毒后機體存活或治療所必需的。

細胞免疫和體液免疫是分別由T、B淋巴細胞介導的免疫反應。以淋巴細胞基因缺失小鼠為模型研究其對狂犬病病毒的敏感性發現，CD8+T細胞基因敲除小鼠對病毒不敏感，而T、B細胞缺失小鼠或B細胞缺失小鼠對病毒的敏感性增加。此外，B細胞缺失但有功能性CD4+T細胞和CD8+T細胞的JHD小鼠，在感染狂犬病病毒致弱毒株后，盡管不能完全清除CNS中的病毒，但其存活時間明顯延長。因此，T淋巴細胞及B淋巴細胞在控制RABV感染中均具有重要作用。

3.2.4.2 致病性免疫應答

免疫不完全的動物通常比未免疫動物死的更快的“早死現象”同樣支持了免疫應答可增加致病性的觀點。Prabhakar及Smith等研究發現RABV感染后免疫缺陷小鼠比正常小鼠存活時間長，表明免疫應答可加速RABV感染動物死亡。感染RABV的免疫缺陷小鼠注射免疫血清或過繼免疫狂犬病康復動物淋巴細胞后，同樣可加速其發病與死亡，說明抗病毒免疫血清同樣可增強病毒致病性。狂犬病病毒入侵、復制及在CNS傳播與激活抗病毒免疫應答所需時間之間的短暫平衡共同決定了免疫介導的CNS組織損傷。因此不難理解RABV感染的人或動物存活后留有嚴重的神經系統后遺癥，這主要是由病毒從CNS的清除所致。

Prosniak研究發現RABV感染小鼠腦內一些利于病毒復制的生長因子及細胞功能均上調，可能是免疫效應因子誘導了這些分子的表達。此外，不同的RABV均可在體外多種細胞內增殖［20］。這些數據均表明，先天性或適應性免疫應答可能直接或間接提高病毒的復制與傳播。Roy發現免疫細胞也可感染RABV，因此這些細胞可能將病毒從低神經支配區域傳遞至高神經支配區域，進而加速病毒進入CNS，這或許能解釋近年來發生的RABV可通過器官移植進行傳播。

盡管保護性免疫應答對清除狂犬病病毒感染有重要作用，及時并適當的免疫應答可阻止致死性結果，但免疫應答通常也會增強病毒的致病性，功能性的免疫病理通常與病毒的清除密切相關。在感染到達CNS的重要區域時，保護性免疫應答可加速動物的死亡。因此，感染途徑、RABV傳播至CNS的能力、在不引發保護性免疫反應情況下病毒進行復制的特性、免疫應答產生的時間、免疫反應的本質共同決定了暴露后的結果。

狂犬病是一種烈性的接觸性傳染病，是危害人類和家畜的主要疾病之一。實驗動物模型特別是嚙齒動物模型的建立，已在狂犬病的致病機制及治療措施中得到了廣泛應用，對預防、控制和治療狂犬病的發生有重大意義，但嚙齒類動物實驗模型對研究自然感染還存在極大的局限性。此外還有一個問題值得關注，研究使用的病毒粒子數比唾液中傳播的病毒粒子數要多，但這是保證成功建立病毒感染模型所需。以后的工作旨在建立更完善的模型用于更好的再現自然感染現象，更好的應用于對狂犬病的研究。

4 人獸共患病研究中的新動物模型研究

4.1 野生動物的實驗動物化研究

我國擁有豐富的野生動物資源優勢，有針對性的加強和加快野生動物的開發和實驗動物化，對提升實驗動物資源的豐富程度，推動我國實驗動物科學的發展，為生命科學研究提供有力的支撐條件起著重要的作用。

4.1.1 樹鼩

⑨愛新覺羅·弘歷:《安瀾園記》，于敏中等編纂:《日下舊聞考》卷八二《國朝苑囿》，北京古籍出版社2001年版，第1366頁。

樹鼩屬于哺乳綱攀鼩目，我國從20世紀70年代開始樹鼩的人工馴養繁殖，目前僅昆明地區就有近十個單位從事樹鼩的馴化繁殖和銷售。樹鼩曾用于甲型肝炎病毒、輪狀病毒、單純皰疹病毒、登革病毒的研究。新近的研究表明樹鼩可作為研究乙型、丙型和丁型肝炎的實驗動物，而且還有望作為艾滋病病毒研究的實驗動物。

4.1.2 東方田鼠

東方田鼠可作為血吸蟲抗病模型，該動物對血吸蟲感染具先天抗性。日本血吸蟲尾蚴感染東方田鼠后，盡管蟲體在感染后11d內能正常發育，但從第12天開始，蟲體生長發育停滯，第20～28天蟲體在體內全部消亡。研究人員將東方田鼠體內對日本血吸蟲童蟲有明顯殺滅作用的基因和蛋白質轉入小鼠體內，可提高小鼠抗日本血吸蟲的能力。采用東方田鼠感染血清篩選到數個新的血吸蟲抗原基因，提出了新的疫苗候選分子。

4.1.3 布氏田鼠

1994年，布氏田鼠作為實驗用動物被引入實驗室。鼠疫桿菌經布氏田鼠適應后對人的致病力減弱，可用于研究宿主感染相關機制。SARS-CoV可以有效感染布氏田鼠，成年布氏田鼠比幼年動物對SARS-CoV更敏感。布氏田鼠有望成為一種比較理想的小型SARS動物模型。

4.1.4 旱獺

旱獺屬于嚙齒目松鼠科，是一種公認的研究人類乙型肝炎（HBV）動物模型，可用于感染和致病機制研究。患有慢性撥鼠肝炎的旱獺是人類HBV慢性感染的抗病毒治療的臨床前評估最有價值的動物模型。

4.2 生物技術在新型實驗動物研究中的應用

隨著生物學技術迅猛發展，特別是基因敲除技術和轉基因技術在實驗動物模型研究中的廣泛應用，從而使實驗動物品種、品系及具有特定特征的模型動物種類數量快速增長。通過對這些模型的研究，可為發病機制與藥物靶點篩選提供新的思路。

基因敲除又稱基因打靶，通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，精細地定點修飾和改造基因DNA片段。研究人員已應用該技術成功構建了心血管疾病、神經退化性疾病、糖尿病、癌癥等小鼠模型。2002年，賴良學等用核移植的方法獲得了敲除了α-1，3-半乳糖苷酶基因的克隆豬，是第一個將該技術應用于大型哺乳動物的成功工作。

轉基因技術是指將具有特殊性狀的外源基因轉入動物整合表達，使定向改變動物性狀成為可能。轉基因技術在動物基因表達調控、癌癥動物模型、基因治療與腫瘤學等諸多領域中發揮著巨大的作用。將小兒麻痹病毒的細胞性受體基因（human PVR gene）顯微注射至C57BL/10小鼠的早期胚胎中，制作轉基因小鼠并育成品系。這種小鼠表達人源的受體，有小兒麻痹病毒的感受性。而且感染了這種病毒的小鼠表現出和人一樣的臨床癥狀，對病毒株的特異性也表現出與人相同的性質。因此，這種小鼠除了是人的疾病模型之外，同時還可能替代猴子進行小兒麻痹病毒的效果、特異性等的檢定，具有廣泛的用途。此外在傳染病研究中，抗病轉基因動物也成為了研究熱點。

5 人獸共患病與實驗動物的健康

感染實驗動物的人獸共患病會造成實驗動物的死亡和質量下降，導致實驗失敗，而且還會危害人類和其它動物的健康。對實驗動物危害嚴重的人獸共患病包括流行性出血熱、狂犬病、流感、沙門氏菌、布氏桿菌、弓形體、鉤端螺旋體病等。還有一些動物傳染病會嚴重威脅到實驗動物的健康如：鼠痘、犬瘟熱、貓瘟熱、犬出血性腸炎和兔瘟等。

5.1 流行性出血熱

流行性出血熱（EHF）又稱腎綜合征出血熱（HFRS）是由漢坦病毒引起傳播的一類人獸共患傳染病，黑線姬鼠、田鼠和小家鼠是主要的儲存宿主和傳染源。人、大鼠、小鼠、豚鼠和兔均易感，因此該病對人和實驗動物健康均構成威脅。目前我國大陸的31個省、市、自治區均有病例發生，臺灣也有病例報告。年發病數最高曾超過11萬，近十年來發病人數一直在2～5萬左右。國內多次發生因實驗動物攜帶病原而導致人的感染。如2001年6月，在北京，因使用不合格實驗動物和實驗不規范致使流行性出血熱感染研究人員，導致700多師生緊急預防接種；2002年11月湖北省藥檢學校的一名學生接觸了帶出血熱病毒的實驗動物而感染死亡；2006年，東北三省由于個體戶繁養和長途販運不合格實驗動物致使幾十名教學科研人員感染。

5.2 布魯氏菌病

布魯氏菌病（簡稱布病）是由布魯氏菌引起的一種人獸共患傳染病，該病廣泛分布于世界各地，據報道有170多個國家和地區有布病疫情，其中人布病發病率超過1/10萬的國家有19個，每年新發病人數超過50萬人。55個國家的綿羊、山羊有布病流行，33個國家的豬有布病存在。每年造成的經濟損失高達數百億美元。近十幾年來，該病發病率在世界范圍內呈上升趨勢。該病對以羊為實驗動物的研究人員威脅嚴重。2010年12月19日，東北農業大學因未按規定使用羊進行動物實驗導致28名師生感染。犬科動物也有感染布魯氏菌的報道，應引相關人員的重視。

5.3 弓形蟲病

弓形蟲病是一種重要的動物源性人獸共患寄生蟲病，弓形蟲和其它頂復亞門原蟲不同，生活史復雜，宿主類型多，組織寄生性廣泛，病程長而隱匿。估計全世界至少有三分之一的人感染弓形蟲，1985年的調查發現美國感染率為84％、法國為90％，我國1986年調查發現抗體陽性率為5.169％。弓形蟲的終未宿主為貓和貓科動物，中間宿主為人、小鼠、家鼠，其它哺乳類，鳥類和爬行類等。

5.4 鼠痘

鼠痘病毒，又名脫腳病，是實驗小鼠最嚴重的病毒之一，傳播快，死亡率高。小鼠，特別是A系、C3H、DBA/2、BALB/C、CBA等品系小鼠。國內普通實驗鼠抗體陽性率為30％～70％。

5.5 犬瘟熱

犬瘟熱是對犬科動物危害最大的一種病毒性傳染病，貓科動物及大熊貓等動物均可感染。臨床上主要表現為發熱、膿性鼻炎、肺炎、腸炎和結膜炎，有時出現神經癥狀。該病傳染性強，發病率可達100％，病死率達80％。該病對犬科實驗動物威脅較大，更重要的是還發現該病可跨種傳播感染彌猴。2006年至2009年期間，我國廣西、湖北、云南等地養猴場、動物園和靈長類實驗動物中心爆發多起無明顯季節性、群體性恒河猴、食蟹猴類似麻疹的感染，其臨床癥狀為高燒、典型上呼吸道感染及卡他癥狀、咽喉紅腫、舌頭乳頭點狀出血、皮疹、腹瀉及嚴重肺炎，其中幼齡恒河猴易感，發病率約60％，死亡率高達30％，成年恒河猴發病率約25％，死亡率約5％。疫情使得猴場經濟損失嚴重、動物實驗中心有關猴的動物實驗不能進行。我們通過病原分離，序列測定（GenBank：FJ405224和FJ405225）和犬與雪貂的人工感染實驗證實此次大規模猴群發病為麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒強毒株。

6 結論與展望

實驗動物是人獸共患傳染病研究的重要支撐平臺。有人統計生物醫學的科研課題有百分六十以上需要用實驗動物，甚至有許多課題的研究離開了實驗動物就寸步難行。我國也已成立了專門的研究中心與管理體系。今后還要進一步制定并執行相關管理法規，保證實驗動物質量，符合國際統一的標準和規定。同時在人獸共患傳染病研究中更廣泛的應用實驗動物，為保障人類健康服務。

［1］Schulman，J.，Experimentaltransmission of influenzavirus infection in mice［J］.The Journal of Experimental Medicine，1967.125（3）：p.467.

［2］Gao，Y.，Y.Zhang，K.Shinya，et al.，Identification of amino acids in HA and PB2 critical for the transmission of H5N1 avian influenza viruses in a mammalian host［J］.PLoS Pathog，2009.5（12）：p.e1000709.

［3］Jackson，S.，N.VanHoeven，L.M.Chen，etal.，Reassortment between avian H5N1 and human H3N2 influenza viruses in ferrets：a public health risk assessmen［J］t.J Virol，2009.83（16）：p.8131-8140.

［4］Octaviani，C.P.，M.Ozawa，S.Yamada，et al.，High genetic compatibility between swine-origin H1N1 and highly pathogenic avian H5N1 influenza viruses［J］.J Virol，2010.

［5］Hou，X.Q.，Y.W.Gao，S.T.Yang，et al.，Role of macrophage migration inhibitory factor in influenza H5N1 virus pneumonia［J］.Acta Virol，2009.53（4）：p.225-231.

［6］Smith，J.H.，T.Nagy，E.Driskell，et al.，Comparative Pathology in Ferrets Infected with H1N1 Influenza A Viruses Isolated from Different Hosts［J］.J Virol，2011.85（15）：p.7572-7581.

［7］Fan，S.，Y.Gao，K.Shinya，et al.，Immunogenicity and protective efficacy of a live attenuated H5N1 vaccine in nonhuman primates［J］.PLoS Pathog，2009.5（5）：p.e1000409.

［8］Baskin，C.R.，H.Bielefeldt-Ohmann，T.M.Tumpey，et al.，Early and sustained innate immune response defines pathology and death in nonhuman primates infected by highly pathogenic influenza virus［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009.106（9）：p.3455-3460.

［9］Zhang，T.，C.Y.Wang，W.Zhang，et al.，Generation and characterization of a fusion protein of single-chain fragment variable antibody against hemagglutinin antigen of avian influenza virus and truncated protamine［J］.Vaccine，2010.28（23）：p.3949-3955.

［10］Zhang，T.，P.S.Zhao，W.Zhang，et al.，Antisense oligonucleotide inhibits avian influenza virus H5N1 replication by single chain antibody delivery system［J］.Vaccine，2011.29（8）：p.1558-1564.

［11］Murphy，F.A.and S.P.Bauer，Early street rabies virus infection in striated muscle and later progression to the central nervous system［J］.Intervirology，1974.3（4）：p.256-268.

［12］Tuffereau，C.，K.Schmidt，C.Langevin，et al.，The rabies virus glycoprotein receptor p75NTR is not essential for rabies virus infection［J］.J Virol，2007.81（24）：p.13622-13630.

［13］Hotta，K.，Y.Motoi，A.Okutani，et al.，Role of GPI-anchored NCAM-120 in rabies virus infection［J］.Microbes Infect，2007.9（2）：p.167-174.

［14］Wen，Y.，H.Wang，H.Wu，et al.，Rabies virus expressing dendritic cell-activatingmoleculesenhances the innate and adaptive immune response to vaccination［J］.J Virol，2011.85（4）：p.1634-1644.

［15］Camelo，S.，M.Lafage，A.Galelli，et al.，Selective role for the p55 Kd TNF-alpha receptor in immune unresponsiveness induced by an acute viral encephalitis［J］.J Neuroimmunol，2001.113（1）：p.95-108.

［16］Wang，Z.W.，L.Sarmento，Y.Wang，et al.，Attenuated rabies virus activates，while pathogenic rabies virus evades，the host innate immune responses in the central nervous system［J］.J Virol，2005.79（19）：p.12554-12565.

［17］Phares，T.W.，M.J.Fabis，C.M.Brimer，et al.，A peroxynitrite-dependent pathway is responsible for blood-brain barrier permeability changes during a central nervous system inflammatory response：TNF-alpha isneithernecessary nor sufficient［J］.J Immunol，2007.178（11）：p.7334-7343.

［18］Phares，T.W.，R.B.Kean，T.Mikheeva，et al.，Regional differencesin blood-brain barrierpermeability changesand inflammation in the apathogenic clearance of virus from the central nervous system［J］.J Immunol，2006.176（12）：p.7666-7675.

［19］Galelli，A.，L.Baloul，and M.Lafon，Abortive rabies virus central nervous infection is controlled by T lymphocyte local recruitment and induction of apoptosis［J］.J Neurovirol，2000.6（5）：p.359-372.

［20］Prosniak，M.，D.C.Hooper，B.Dietzschold，et al.，Effect of rabies virus infection on gene expression in mouse brain［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2001.98（5）：p.2758-2763.