基因打靶技術在現代生物學研究中的應用

楊 曉

（蛋白質組學國家重點實驗室，軍事醫學科學院生物工程研究所發育和疾病遺傳學研究室，北京 100071）

盡管基因打靶技術的先驅者2007年才獲得諾貝爾生物學或醫學獎，基因打靶技術在現代生物學研究中的應用卻已經有25年的時間。基因打靶技術的發明和應用革命性地改變了現代生物醫學研究的面貌，催生了許多生物醫學和藥物研發領域的前沿研究，并直接導致了生物醫學研究領域中的許多突破性進展。基因打靶技術的發明使得科學家第一次能對關于特定基因生理功能的假設進行實驗驗證，并通過基因打靶研究真正建立基因和疾病間的因果關系。近年來，基因打靶技術在現代生物學研究中的應用日益深入和廣泛。本文將簡要介紹相關領域的部分新進展，以及我們實驗室在利用基因打靶技術研究轉化生長因子-β信號通路維持組織穩態和抑制疾病發生的生理功能和機制方面的新發現。

1 基因打靶技術在基因組功能研究中的應用

在過去的二十年中，基因打靶技術已經幫助研究者揭示了大約5000種哺乳動物基因的生理功能［1］。這些研究極大地促進了人類對哺乳動物發育和穩態維持過程中生理和病理現象及其調控機制的認識。從來沒有一種技術像基因打靶技術這樣全面而深刻地影響了幾乎所有生物學和醫學研究領域的進展。僅以近兩年為例，通過對組織特異性表達活化型RAS突變體轉基因小鼠以及多種基因敲除小鼠的分析，Tang等研究者發現RAS調節的ERK1/2通路通過控制有絲分裂紡錘體角度決定肺管的形狀［2］。Fujiwara等人通過對nephronectin基因敲除小鼠的研究，發現毛囊膨隆處的干細胞通過表達nephronectin創造平滑肌細胞的niche，并行使立毛肌肌腱細胞的功能［3］。多個課題組通過對Pdgfrb基因敲除小鼠的研究，發現了周細胞維持血腦屏障的重要生理功能［4，5］。Goetz等人通過對caveolin-1基因敲除小鼠的研究，發現基質細胞中的caveolin-1通過調節微環境生物應力重塑促進腫瘤侵襲和轉移［6］。

近年來，基因敲除技術開始揭示細胞內一種重要的非編碼RNA-miRNA在哺乳動物發育和穩態維持過程中的生理功能。miRNA是一種大小約為21～23個堿基的單鏈小分子RNA，由具有發夾結構的約70～90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成［7］。這些非編碼小分子RNA與靶基因mRNA分子的3’端非編碼區域（3’UTR）或者編碼區互補配對后，主要通過降低mRNA分子穩定性和翻譯抑制兩種方式參與靶基因表達調控［8，9］。miRNA基因敲除小鼠的研究結果顯示，miRNA能夠決定特定發育過程的轉換，但更多的時候對特定發育過程或者細胞功能起到精細調節的作用［10，11］。相當數量的miRNA基因敲除小鼠沒有易觀察的表型，或者僅在應激或者損傷時表現出與野生型不同［12-14］。可以預期，未來更多miRNA或者其他非編碼RNA基因打靶小鼠的研制和分析將有助于解析非編碼RNA的作用模式及其生理功能。

為了高效而迅速地解析全基因組編碼基因的生理功能，研究者一直致力于全基因組誘變策略的探索。用于小鼠全基因組誘變的策略和技術方法包括ENU化學誘變、轉座子誘變和基因誘捕。利用基因誘捕構建的隨機插入誘變的胚胎干細胞，大約覆蓋基因組中一半的編碼基因。然而，基因誘捕等位基因無法被精確設計，且在胚胎干細胞中表達的基因更容易中靶。

近年來，條件基因打靶技術因為能夠對基因打靶進行時間和空間上的精確調控，迅速取代了傳統的完全基因敲除技術，成為在生物整體水平上進行基因和基因組功能研究的主流。為了克服基因誘捕技術的缺陷，研究者建立了高通量的條件基因打靶策略，構建全基因組范圍內所有編碼基因的報告基因標記的條件基因打靶等位基因。迄今為止，已經構建了12000打靶載體，篩選到9000種條件中靶C57BL/6N胚胎干細胞［1］。通過囊胚注射檢測了數百種中靶胚胎干細胞整合到生殖系的能力，結果顯示65％的中靶胚胎干細胞可以整合到嵌合體小鼠的生殖系［15］。這種高通量的條件基因敲除小鼠資源庫的構建為研究者在動物整體水平上解析基因功能提供了便利，也為高通量大規模表型分析提供了可能性。

2 基因打靶技術在人類疾病模型研究中的應用

遺傳修飾小鼠疾病模型的應用極大地推動了轉化醫學研究進展。通過基因打靶技術研制的人類疾病小鼠模型保守估計也有數百種。通過對人類疾病小鼠模型的表型研究，可以揭示疾病發生的病理學和分子機制；可以快速解析各種編碼基因以及非編碼基因在疾病病理過程中的作用及其機制，為相關疾病的預防、診斷和治療提供分子靶標。同時，人類疾病小鼠模型也可以作為藥物篩選與評價的強有力的工具。例如，最近研究者通過對p63基因敲除小鼠的研究，發現食管癌的癌前病變Barrett食管起源于一種獨特的胚胎上皮細胞。這種上皮細胞位于鱗狀上皮和柱狀上皮的交界處，鱗狀上皮的損傷將誘發這種上皮細胞向相鄰的特化的鱗狀細胞遷移，并發展為Barrett食管。這一發現為理解食管癌的發生提供了全新的病理機制［16］。利用人類疾病小鼠模型結合高通量篩選技術發現了很多疾病的診斷標志分子。研究者利用PTEN基因敲除導致前列腺癌的小鼠模型高通量篩選差異分子，發現TGFβ/BMP-SMAD4信號通路激活。進一步敲除Smad4導致前列腺癌侵襲和轉移。深入研究結果發現cyclin D1，SPP1，PTEN和SMAD4可以作為前列腺癌發生和致命轉移的診斷標志分子［17］。研究者最近還報道了利用小鼠模型成功地篩選到可用于阿爾茨海默病診斷的候選IgG生物標志分子［18］。利用一種遺傳修飾的急性髓性白血病小鼠模型，研究者從shRNAs文庫中篩選到并確定Brd4（bromodomain-containing 4）可作為有效治療白血病的靶分子。抑制Brd4表達促進髓系終末分化并消除白血病干細胞［19］。這一研究又一次確證了人類疾病小鼠模型在藥物篩選中的價值。利用一種血友病B小鼠模型，研究者證實鋅指核酶能夠在小鼠肝臟中介導特異位點的基因置換，有效改善疾病癥狀［20］。該研究顯示有可能通過基因組編輯治療遺傳病，這為血友病以及其他遺傳病的治療提供了一種全新的可能性。研究者利用Pdx1基因敲除導致胰腺發育不全的小鼠，在其囊胚中注射大鼠多能干細胞，成功地在嵌合體小鼠體內發育成了正常行使功能的大鼠胰腺［21］。這一研究證實可以通過種間囊胚補償在異種生理環境下獲得供體多能干細胞來源的組織器官，為干細胞治療提供了激動人心的新機會。

基因打靶在除小鼠之外的模式生物中也陸續獲得成功，為研制更理想的人類疾病動物模型提供了新的機會。長期以來，因為缺乏能進種系的大鼠胚胎干細胞，利用同源重組技術對大鼠的基因組進行修飾一直沒有獲得成功。直到最近，研究者才報道了腫瘤抑制基因p53基因敲除大鼠的研制和鑒定［22］。結合大鼠在生理學和藥理學研究方面的優勢，基因敲除大鼠將為人類深刻理解疾病發生的病理和分子機制提供新的平臺。

3 TGF-β信號通路維持組織穩態的生理功能和機制

我們實驗室近年來一直研究TGF-β/Smad4信號通路維持組織穩態抑制疾病的生理功能和機制。首先，我們建立了基于Cre-LoxP系統的小鼠條件基因打靶技術平臺，自主研制了13種組織特異性表達Cre重組酶的轉基因小鼠［23-47］，包括在國際上首先報道的腦血管內皮細胞［23，24］、肥大型軟骨細胞［25］和胃頂細胞［26］特異性表達Cre重組酶的轉基因小鼠，以及在國內首先研制的血管內皮細胞［28，29］、平滑肌細胞［29，30］、心肌細胞［31，32］、肺上皮細胞［23］、胃上皮壁細胞［33］、角質細胞［34-37］、胰腺細胞［38］、肝細胞［39］、成骨細胞和成牙本質細胞［40-43］、早期成骨細胞［44］、軟骨細胞［45-47］表達Cre重組酶的轉基因小鼠。利用組織特異性條件基因敲除技術，發現了Smad4通過調節組織干細胞動員和自我更新、細胞增殖和分化、細胞-細胞間相互作用，抑制皮膚癌、食管癌、骨質疏松、心肌肥厚、顱內出血等疾病的重要生理功能和機制［23-47］。

最近，我們報道了世界上首例腦血管內皮細胞特異性條件基因敲除小鼠的研制和分析［24］。通過對腦血管內皮細胞Smad4基因敲除導致顱內出血小鼠模型的表型分析，闡明了腦血管內皮-周細胞相互作用維持血腦屏障和腦血管穩態的重要生理功能及其調控機制，為理解新生兒顱內出血和成人腦中風的發生機制提供了全新的理論基礎和實驗模型。此前的研究雖然揭示了周細胞維持血腦屏障和微血管穩定性的生理功能，然而，人們對內皮細胞-周細胞相互作用的遺傳調控機制仍然知之甚少。我們的研究顯示，腦血管內皮細胞Smad4缺失的小鼠因顱內出血死于圍產期。該小鼠腦血管的通透性顯著增強，其血腦屏障功能下降。腦血管內皮細胞增殖能力顯著增加，其特化和分化正常，但與周細胞不能緊密接觸，造成血管擴張和血管瘤的形成。體外的共培養實驗證實內皮細胞的Smad4信號缺失導致內皮細胞-周細胞的相互作用缺陷。進一步的機制研究發現，Smad4通過與Notch的胞內段共同結合在N-cadherin啟動子的RBP-J結合位點發揮對N-cadherin的轉錄調節作用，進而穩定腦血管內皮細胞-周細胞的相互作用并維持腦血管的完整性。

我們的工作還揭示了受TGF-β信號調節的非編碼小RNA調節成肌分化和心臟穩態的功能和機制，為理解TGF-β信號維持組織穩態的生理功能提供了新的表觀遺傳機制［48，49］。我們利用心肌細胞特異性Smad4基因敲除導致心肌肥厚小鼠的心臟及其對照小鼠的心臟通過miRNA芯片雜交進行差異miRNA篩選，發現miR-24、miR-27b等miRNA在心肌肥厚小鼠心臟組織中表達顯著上調。進一步的研究發現miR-24在成肌分化過程中顯著上調并能被TGF-β1所抑制，并證明了miR-24在調節TGF-β1依賴的成肌分化抑制作用中的關鍵功能［48］。體外體內的研究結果都證明miR-27b過表達導致心肌肥厚。體外實驗顯示miR-27b的表達能被TGF-β1。miR-27b過表達導致心肌細胞肥大性生長，而降低miR-27b表達可以顯著抑制由苯腎上腺素（PE）或者miR-27b過表達導致的心肌細胞肥大性生長。進一步動物整體水平的研究結果表明，心肌細胞特異性表達miR-27b足以誘發轉基因小鼠發生心臟肥大和功能失調。分子機制上，發現miR-27b直接靶向過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）從而促進心肌肥大。特別有意義的是，在一種壓力負荷導致心肌肥厚的小鼠模型中用antagomir阻斷miR-27b的表達可以顯著上調PPAR-β的表達，減輕心臟肥大和功能失調。這些結果證明了受TGF-β信號通路調節的miR-27b在心肌肥厚中的作用，并提示miR-27b可作為心臟肥大治療的有效靶標［49］。

這些在動物整體水平上開展的系統研究，證明了TGF-β/Smad4重要信號通路失調導致組織穩態失衡及其與疾病發生間的因果聯系，為理解多種重要疾病的發生機制奠定了新的理論基礎。

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