高原藏系綿羊EPAS1基因的克隆以及組織表達研究

烏仁塔娜 劉 芳 白振中 嘎 琴 格日力

（青海大學醫學院高原醫學研究中心，青海 西寧 810001）

EPAS1是哺乳動物機體功能在缺氧條件下的重要氧依賴轉錄激活因子。其蛋白屬于bHLH-PAS轉錄因子家族成員，由氧敏感的α亞基和核內穩定表達的β亞基以異源二聚體形式存在。近來越來越多的研究發現，EPAS1參與諸多低氧有關的下游基因的表達調控，從而在低氧調控機制中發揮重要作用[1,2]。因此結合我們正在開展的有關低氧獲得性習服相關的研究，對青藏高原獲得性習服物種藏系綿羊EPAS1的基因進行了克隆及序列分析，以便為進一步研究高原獲得性習服以及急慢性高原病的發病機制的研究提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2009年4月在青海省可可西里國家級自然保護區（海拔4300m）捕獲雄性藏系綿羊10只，捕捉后立即運至格爾木市（海拔2800m）解剖取藏系綿羊各組織，迅速投入液氮容器中，低溫保存并運回西寧。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及鑒定

按照Trizol試劑盒說明提取藏系綿羊肺組織總RNA，溶于20μL DEPC水中，并用DU800核酸蛋白含量檢測儀測定A260/A280值及濃度，并進行1%甲醛變性凝膠電泳檢測其質量，置-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 目的基因擴增及序列測定

引物設計：利用GenBank中人、小鼠、大鼠、牛和牦牛的EPAS1 cDNA序列用ClustalW進行同源性對比。

目的基因的擴增：取總RNA 2.0μg，按照AMV逆轉錄酶試劑盒逆轉錄合成cDNA第一鏈。PCR反應體系：模板cDNA 1μL，PCR Master Mix 15μL，EPAS1上下游引物各1μL，加水補足至25μL；擴增條件為：95℃預變性5min后進行35個循環，每循環95℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，循環結束后72℃延伸10min。取PCR產物10μL 進行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，采用紫外凝膠成像分析系統記錄電泳結果。

PCR產物的回收、純化及序列測定：用 QIAquick Gel 回收試劑盒回收純化456bp PCR擴增片段并連接到 pGEM-T Easy載體上。通過藍白斑篩選實驗挑取白斑單克隆，接種后37℃搖床過夜，然后提取質粒，用EcoRⅠ酶切電泳，選出含有目的片段的陽性克隆送上海英俊生物生物技術有限公司進行序列測定。將獲得的基因序列在GenBank上進行Blast初步比較分析和在ClustalX上進行物種同源性比較。

1.2.3 熒光定量PCR

采用CluxtalW軟件對人、大鼠、小鼠、牛的Beta- actin，EPAS1，EPO的序列進行同源性比對。定量PCR由iCycler 定時定量PCR儀來完成。結果顯示溶解曲線只出現一個主波峰，說明PCR擴增的特異性較高，符合實時熒光定量的技術要求。

2 結 果

2.1 目的基因的PCR擴增及測序結果分析

用DNAMAN軟件，將藏系綿羊EPAS1基因測序序列與其他物種進行同源性比較分析，結果顯示與人、大鼠、小鼠、牛的EPAS1基因的同源性分別達到了94%、91%、92%、98%的同源性。

2.2 熒光定量PCR（ΔΔCt方法）檢測結果

以β-actin為內參基因，計算藏系綿羊各個組織的EPAS1的ΔCt。可以看出EPAS1基因mRNA的表達量在心臟中最高，約是肺臟的1.8倍，在肝臟中表達量的2.5倍，約是在腎中表達量的7.57倍。

3 討 論

本研究應用RT-PCR技術首次從草地藏系綿羊肝臟中獲得了EPAS1基因的部分編碼區序列，為進一步研究藏系綿羊EPAS1的表達及其與高原地區獲得性習服機制的研究提供了基礎。我們進行了EPAS1 mRNA在藏系綿羊的心、腎、肝、肺組織中的表達，發現EPAS1基因mRNA在藏系綿羊心臟組織中表達量最高。故可認為在藏系綿羊中EPAS1基因的在心臟中的高表達可能與其在低氧環境下藏系綿羊的心臟保護性改變有著重要的關系。

綜上所述長期適應高海拔低氧的獲得性習服物種藏系綿羊，對低氧已經形成了部分適應性改變，且在分子水平，生理水平，形態水平已經有了一定的改變，這對青藏高原移居物種在低氧習服機制的研究有著重要的價值。通過對藏系綿羊EPAS基因的研究，可以有助于對慢性高原病的發病機制的研究提供理論依據。

[1]管峰,石國慶,劉守仁,等.角蛋白家族及其對羊毛生長發育的調控[J].生命的化學,2007,27(1)：92-94.

[2]謝馥交,盧向陽.克隆全長cDNA的方法及其在獸藥研究中的應用[J].中國獸藥雜志,2006,40(5)：43-47.