結核分枝桿菌L型研究現狀與獸醫臨床＊

于守平,錢愛東,單曉楓,葉麗萍

細菌L型(bacterial L-forms)是細菌在體內外受到各種直接或間接損傷細胞壁的理化和生物因素的影響,其細胞壁受到破壞或細胞壁的合成受阻而轉化成一種細胞壁缺失或缺陷的細菌(cell Wall-deficeint bacteria,CWDB)[1]。結核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis)也同其它細菌一樣,在干擾細胞壁合成或破壞細胞壁結構的因素作用下以及在自然生長繁殖的過程中,發生細胞壁缺陷形成L型(MTB-L)。也有學者認為,細胞壁缺陷是結核分枝桿菌生命活動周期的一個環節[2-3]。在人醫臨床中結核分枝桿菌L型現已引起高度重視,很多大型醫院已開展結核桿菌L型的檢測,吳鳳霞[4]等報道,對結核病人標本進行L型檢測,其檢出率達28.7%,在獸醫臨床上結核菌L型目前還未見報道,但其潛在的危害性應引起足夠的重視。結核分枝桿菌根據致病性可分為結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌,這四種結核分枝桿菌可相互感染[5]。研究發現牛分枝桿菌與結核分枝桿菌基因組的同源性為99.95%,資料統計有10%～15%的結核病患者是由牛分枝桿菌引起的,有的地區兒童感染牛分枝桿菌高達33%[6-8]。目前對牛結核病的控制方法主要實施“檢驗-撲殺”政策,但由于結核分枝桿菌在細胞壁缺失的情況下,其細菌的多種生物學性狀發生改變,易造成細菌學檢查假陰性的結果,加上臨床癥狀不典型,皮內變態反應(PPD)減弱,帶菌牛的 PPD試驗呈陰性,在不同程度上影響了對牛結核病的診斷,使帶菌牛可長期潛伏在健康牛群中,在牛抵抗力降低的情況下L型可大量繁殖或恢復成原菌形成新的傳染源,因此加強對牛分枝桿菌L型的檢測,提高牛結核病的細菌學診斷率,對根除牛結核病具有重要的作用。

1 結核菌L型的形成機制

結核菌L型的形成可以是自發形成,也可以通過外界物理、化學及生物因素誘導產生。分枝桿菌L型最早由Sato等誘導成功[9],他們應用甘氨酸加溶菌酶對生長迅速的無毒分枝桿菌進行誘導而獲得。甘氨酸的誘導作用在于它有替代肽聚糖上丙氨酸的作用,阻礙了肽聚糖的交聯,除甘氨酸外蛋氨酸與蘇氨酸也有類似作用。Willett與 Tha-coro應用溶菌酶加入家兔腹腔巨噬細胞均成功誘導結核分枝桿菌成L型[10]。一般認為誘導結核菌變為L型有如下因素[11-12]:(1)使細菌DNA發生改變的因素,如紫外線、人的膽汁、尿素、亞硝基胍類;(2)直接破壞細胞壁結構的因素,如溶菌酶、噬菌體等。(3)干擾細胞壁合成的因素包括:作用于肽聚糖多肽鏈結構,如青霉素、頭孢菌素及某些氨基酸(甘氨酸作用最佳);作用于肽聚糖多糖鏈結構,如萬古霉素;作用于細胞壁上其他組分,如異煙肼等。(4)宿主體內的某些免疫因素,如抗體、補體、吞噬細胞等。

2 結核菌L型的生物學特性

結核菌變為L型后,其生物學特性與原菌有明顯的不同。(1)培養特性:由于細菌細胞壁的缺陷,L型不能在普通的結核菌培養基上生長,而要在高滲培養基上生長,國內外報道的培養基有胰胨大豆蛋白胨瓊脂培養基(TSA-L培養基),改良胰胨大豆蛋白胨瓊脂培養基(改良 TSA-L培養基)以及L型液體培養基(92-3 TBL)[13]。也有文獻報道,結核菌L型能夠在蘇通培養基、肝消化液等不含滲透壓穩定劑的非高滲培養基內良好生長繁殖和傳代培養[14-15]。(2)菌體形態及染色特性[16-17]:細胞壁的缺失使菌體不能維持正常的形態,呈高度多形性,可呈現大小不等的圓球體(coccoid forms)、巨型體(large body)、絲狀體 (filamentous forms)、原生小體和棒狀體等;結核菌變為L型后,其染色特性與細胞壁的缺失程度有關,一般來說細胞壁部分缺失的結核桿菌L型可仍然保留革蘭氏染色陽性和抗酸染色陽性的特征,但細胞壁完全缺失的結核分枝桿菌L型則通常為革蘭氏染色陰性和抗酸染色陰性。不論是細胞壁完全缺失還是部分缺失的結核桿菌L型,其染色特性均受到菌細胞的代謝活性、培養基條件等因素影響而表現為不規則現象。(3)濾過性[18]:結核桿菌L型在電子顯微鏡下通常可見直徑小于0.1μm的菌體細胞,其大小與中等大小的病毒相似,細胞壁的缺陷使細菌的可塑性增強,使其具有一定的可濾過性,能夠通過0.22μm的除菌濾膜。母體血液中L型細菌可通過絨毛上較大的微孔,或通過微絨毛刷狀緣的胞飲作用進入胎兒血液循環,從理論上支持結核分枝桿菌L型母嬰傳播的可能性。

3 結核菌L型致病性及特點

一般認為結核分枝桿菌細胞壁成分與其病原性有關,因此關于結核菌L型的致病性很多學者的觀點也各不相同。

有學者認為,結核菌L型本身沒有致病性,但恢復為原菌后仍可致病。Ratman[19]等用動物實驗證明結核菌L型本身不引起皮膚遲發性超敏反應,也不引起結核的病理損害,但可以在體內長期存在,并在一定條件下恢復為原菌而導致結核病的發生。但大多數學者認為結核菌L型本身就具有致病性,并用大量的實驗證明了這一觀點。朱明利[20]等用牛型分枝桿菌L型經尾靜脈接種小鼠,再于第13d、21d、36d、56d、73d 各注射 1 次 ,每次 0.2mL,100d后處死全部小鼠,病理剖檢可見小鼠主要臟器有間質性炎癥和多個臟器的增生;病原學檢查可見小鼠臟器有典型的少量抗酸桿菌和大量的分枝桿菌L型。用牛型分枝桿菌接種的母鼠,可發現初生子鼠有灶性淋巴細胞浸潤、畸形、肝小膽管瘤樣增生等病理學現象,說明結核分枝桿菌L型可引起間質性炎癥并通過垂直感染影響胎兒。馬筱玲[21]等將結核菌L型菌液,經腹股溝皮下感染豚鼠,注射常規量0.05mg組豚鼠110d仍不發病,注射2.5mg組豚鼠60～90d發病,剖檢可見豚鼠支氣管旁淋巴結腫大,內有干酪樣壞死物,且各臟器表面有出血點,肝、脾、腎等臟器有輕度的間質性炎癥的表現,未見典型的結核結節形成,表明結核分枝桿菌L型毒力比原菌毒力弱,但仍具有致病性。結核結節形成與干酪樣壞死是結核病在病理學上的特征性變化,但結核桿菌L型感染機體后,未形成典型的結核結節,這與L型細菌細胞壁缺損有關。結核結節的形成是由于結核菌在體內被巨噬細胞吞噬后,細菌細胞壁中的脂質刺激巨噬細胞增生,并轉變為類上皮細胞,類上皮細胞再融合或分裂形成郎罕氏巨細胞,由類上皮細胞、郎罕氏巨細胞、局部聚集的淋巴細胞和纖維母細胞一起構成結核結節。結核菌L型表面脂質缺損,是感染動物后病灶中無結節形成的主要原因[22]。

4 結核核菌L型的遺傳學特征

文獻[23-25]報道結核分枝桿菌變為L型后其多種遺傳特征可發生改變,這可能與細胞壁缺陷導致菌細胞染色體核苷酸片段丟失或基因重排有關。王豫萍[26]等對結核桿菌穩定L型純培養物的染色體DNA特異性聚合酶鏈反應(PCR)擴增產物進行產物單鏈構象多態性(SSCP)分析顯示,穩定L型的染色體DNA保留了與其親代細菌型一致的主要帶型,但也顯示出少數不同于其親代細菌型的DNA條帶,表明結核分枝桿菌穩定L型可保留與其親代細菌型一致的特異性染色體基因,但也發生了染色體基因的點突變。王和[27]研究發現,異煙肼、利福平等抗結核藥物誘導形成的結核分枝桿菌穩定L型的2-5代培養物仍保留著與親代相同的擴增產物,但經多次傳代(一般5代以上)后可發生染色體基因的突變,即在特異性PCR檢測中出現與其親代細菌型有差異的產物,這可能與穩定L型難以自發返祖有關,但此結果和結論仍有待進一步證實。

牛結核病(Bovine tuberculosis)是由牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)和結核分枝桿菌(M.tuberculosis)引起的一種人獸共患的慢性消耗性傳染病,被世界動物衛生組織(OIE)列為B類動物疫病,研究發現牛結核中有7%系結核分枝桿菌感染,而結核病人中10%～15%是由牛分枝桿菌感染,其中有15%以上的病人是通過飲用了患結核病牛的牛奶而感染的。早在1960年世界衛生組織專家委員會第七次會議中指出:“在那些還存在牛結核病的國家中,人類始終受到它的威脅,除非著手撲滅牛結核病,否則人類結核病的控制是不會成功的”[28]。由此可見,牛結核病不僅嚴重影響了畜牧業的持續發展,而且還威脅著人類的身心健康。目前牛結核病的診斷方法有細菌學檢測方法(涂片鏡檢,細菌分離培養,動物實驗等)、免疫學檢測方法(提純結核菌素皮內變態反應,血清學診斷技術)和分子生物學檢測方法,由于分子生物學檢測技術需要較先進的儀器設備,技術相對復雜,對實驗條件和操作人員的要求較高,現階段還很難在生產實踐中普遍推廣,而細菌學和提純結核菌素皮內變態反應(PPD)由于所需材料及設備較為簡單,操作方法簡便,是目前獸醫臨床上用于檢測結核分枝桿菌較為常用的方法[29-30]。由于結核分枝桿菌L型細胞壁不完整,細胞壁上缺乏分枝菌酸和磷脂,抗酸染色多為陰性,另外菌體形態及培養特性也發生改變,常規的細菌學檢測很難檢出;加之皮內變態反應(PPD)減弱,帶菌牛的PPD試驗常呈陰性,也影響患病牛的檢出率。另外,由于結核桿菌L型感染引起的癥狀不典型或表現為非特異性炎癥,導致臨床和實驗室診斷困難而發生漏診和誤診,形成潛在的帶菌者。要徹底根除結核病,必須從根本上消滅結核桿菌,臨床上應對有進行性消瘦、咳嗽、慢性乳房炎、頑固性下痢、體表淋巴結腫脹的牛,采取其病灶、痰、尿糞、乳及其他分泌物進行抹片檢查及結核桿菌L型的分離培養,同時對疑似牛進行皮內變態反應(PPD)試驗,可充分提高帶菌牛的檢出率,控制牛結核病的關鍵是消滅傳染源,因此開展結核分枝桿菌L型檢測至關重要。

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