新城疫病毒抗腫瘤基因的研究進展＊

劉進軍,劉開揚,王 靜

腫瘤的發生與發展是一個多因素、多階段、多基因的復雜變化過程。傳統的腫瘤手術治療只能去除原發病灶,不能從根本上杜絕其再生與繁殖;放化療雖能殺滅腫瘤細胞,但也使大量正常組織細胞受到嚴重損傷。隨著分子生物學、免疫學及病原生物學的發展,特別是新城疫病毒(NDV)溶瘤研究的不斷深入,為控制腫瘤提供了新的思路。為了選擇最佳的溶瘤效果,或者有針對性的讓其表達“治療性蛋白質”,不同毒株型的NDV完全測序成為發展更有效溶瘤研究的基礎。新城疫病毒是禽副粘病毒 I型(APMV-I)的成員,屬于副粘病毒科腮腺炎病毒屬,成熟的病毒粒子一般為圓形,直徑為120 nm～300 nm。病毒粒子是具有包膜的 RNA病毒,其核衣殼直徑17nm～18 nm呈螺旋對稱,由單負股RNA及與其相連的蛋白質NP組成。包膜為脂質雙層膜,脂質膜內襯有一層特殊的基質蛋白M。包膜上附有長約8nm～12nm的糖蛋白(F和 HN)刺突。NDV的基因組結構為 3′-NP-P-M-F-HN-L-5′,分別編碼6種結構蛋白,即核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein,NP)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)、基質蛋白(Matrixprotein,M)、融合蛋白(Fusion protein,F)、血凝素-神經氨酸(Haemagglutininneuraminidase,HN)和大蛋白(Large protein,L)。F、HN蛋白是構成NDV致病性的分子基礎,其中HN蛋白也是抗腫瘤研究的熱點;而F蛋白在鑒定NDV致病性中起主要決定作用。目前研究發現NDV具有很強的非特異免疫刺激作用,能刺激宿主免疫系統產生細胞因子,特別是干擾素,間接地增強CTL細胞的細胞毒作用;另一方面它可以幫助抗原提呈細胞(APC)提呈抗原,增強腫瘤細胞的免疫原性等。為了更好的研究其抗腫瘤的臨床價值,現將病毒基因組特點及溶瘤主要機制總結如下。

1 病毒基因組特點

1.1 新城疫病毒的基因組為一條單股、負鏈、不分節段的 RNA。經典毒株的基因組長度均為15 186bp[1],是所有副黏病毒科成員中最小的。最近發現了全長為15 198bp[2]的毒株,其增加的核酸序列對研究毒性和分類具有重要意義。NDV基因組都有相似的起始序列及終止序列,起始序列為ACGGGTAGA(G)A,終止序列為 TTA(A)GA6-7。基因組中引導序列及尾隨序列是其重要的調控區,在病毒RNA的復制及轉錄過程中起重要的調節作用。NDV基因組為6的倍數,而且這種6堿基規對NDV的復制非常重要。NDV基因轉錄出的各種mRNA均在3′端具有poly(A)尾和在5′端有帽子結構。病毒基因組中NP-P基因間隔區有1個或2個核苷酸,P-M和M-F基因間隔區有1個核苷酸,F-HN和 HN-L基因間隔區分別為17bp和34bp,這些間隔區為我們研究NDV每種蛋白的功能提供了先決條件。

1.2 病毒基因組編碼及其蛋白的功能

1.2.1 核蛋白(NP) NP基因長 1 746bp或1 747bp,編碼489個氨基酸,其5′非編碼區插入6個核苷酸(CTC CCT/CCC CTC/TCC CCA/TCC CCA/CTC CCA等),此特征在種系進化分析中屬于Ⅴ～Ⅵ基因型[2]。NP是NDV核衣殼的主要結構蛋白質,與病毒 RNA共同組成核糖核蛋白(RNP)。每個病毒粒子含有1 600個～2 000個NP單體,抗原性穩定,其抗體無中和病毒的能力。NP與F、HN基因表達的蛋白能夠與腫瘤細胞的癌基因或其調節基因結合阻止癌基因的表達,從而抑制腫瘤生長或使腫瘤細胞逆轉為正常細胞;同時可以引起了腫瘤細胞的凋亡。

1.2.2 磷蛋白(P) P基因 ORF長 1 188～1 451bp,編碼395個氨基酸。P蛋白是RNA依賴的RNA聚合酶的兩個亞單位之一,也是NP蛋白的分子伴侶,它可以阻止NP蛋白對非病毒 RNA及病毒mRNA的“非法”衣殼化[1]。

1.2.3 基質蛋白(M) M 基因長1 241bp,編碼364個氨基酸,其246～263中有兩個堿性氨基酸序列,此特征可作為核酸定位信號,利用 RT-PCR技術可用來初篩任何NDV[3]。基質M蛋白不僅對病毒起保護作用,而且通過與細胞膜、病毒糖蛋白的胞質區以及核衣殼的相互作用而參與病毒的裝配過程。M蛋白還有抑制宿主細胞mRNA轉錄和蛋白質合成的作用,對于腫瘤細胞而言,M蛋白抑制了瘤細胞的增殖,促進其凋亡。

1.2.4 融合蛋白(F) F基因長1 792bp,編碼553個氨基酸多肽F0,前體蛋白F0經蛋白水解后成為F1和 F2,此水解過程依賴于宿主細胞及NDV的株型。F0必須在裂解區(第112位至第117位氨基酸)的116位與117位氨基酸之間被裂解為F1和F2兩條多肽后,才能使病毒粒子具有感染性及復制增值的能力。F蛋白位于病毒的包膜上,是病毒感染宿主細胞時穿入的一個重要成分。通過它完成病毒包膜與細胞膜的融合,使病毒穿過細胞膜而進入到細胞內進行復制,同時F蛋白還介導感染病毒的細胞和相鄰細胞之間的融合,導致多核巨細胞或合胞體的產生。F蛋白決定NDV的致病性,且是主要的分毒型依據。強毒株型的F蛋白具有的特征是:F0蛋白裂解位點具有兩對堿性氨基酸殘基(112R/K-R-Q-R/K-R-F117)[2],這種結構決定其很強的致病性,而且此序列決定蛋白水解酶的普遍性,即感染和溶瘤的普遍性[4];相反,NDV的弱毒株的序列(112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117)[2]決定其感染受細胞類型所限制,僅能被呼吸道和消化道上皮分泌的胰酶樣酶裂解,即感染和溶瘤的局限性,其 F0蛋白裂解位點僅具有兩個單獨的堿性氨基酸殘基并且限制蛋白水解酶活性;而中等強度毒株型F0蛋白裂解為點可以具有兩對堿性氨基酸殘基,或單獨的一個精氨酸和一個賴氨酸或一對精氨酸。這些在F基因序列上的不同決定著不同NDV毒株表型在分子生物學的鑒定和分群。基于系統進化分析法中部分F基因測序及酶切圖譜特征,NDV株可以分為Ⅰ～Ⅸ基因型。每個有特定酶切圖譜特征的基因型所包含的分離株,在地域或流行病學上相互關聯。

1.2.5 血凝素-神經氨酸酶(HN) 不同的NDV毒株的 HN基因長度不同,主要有 1 713 bp、1 731 bp、1 848 bp三個亞型[5],該序列里有4個極保守的和1個相對保守的糖基化位點(Asn-X-Ser/Thr),據報道糖基化對神經氨酸酶的作用是必要的;還有12個極保守的和1個相對保守的半胱氨酸殘基[5],這些殘基對 HN蛋白的成熟尤其是二聚體形成具有重要的作用,但與其毒力無關。HN是構成NDV包膜上較大的纖突樣糖蛋白的主要成分,它兼有血凝素和神經氨酸酶兩種活性。通過介導病毒與宿主細胞受體的吸附而在感染中起著重要作用,HN的血凝素成分負責識別易感細胞的含唾液酸的受體并吸附上去,神經氨酸酶則有分解和破壞受體的能力,并促進新生的病毒粒子從感染的細胞膜上釋放。

1.2.6 大分子蛋白(L) L基因長6 615bp,編碼2 204個氨基酸,是基因組中最保守的序列,其6個高度保守序列可用于鑒定Ⅰ型毒株NDV,如果聯合M基因的RT-PCR就可以鑒定出Ⅰ和Ⅱ基因型[3]。L蛋白是病毒RNA聚合酶的兩個亞單位之一,它與P蛋白形成的復合物具有完整的RNA聚合酶活性,參與RNA轉錄和復制的大部分酶的活性都存在于L上,如病毒 RNA多聚酶、mRNA加帽酶、poly(A)多聚酶和磷酸激酶等[4],這些酶并不能利用裸露的核酸作為模板,但能識別螺旋狀且有NP纏繞的核衣殼[4]。

1.2.7 W及V蛋白 P基因在轉錄過程中會在其484位(AAAAA GG↓G)發生編輯現象而產生兩個額外的蛋白質W及V,它們和P蛋白含有相同的N端,但是具有不同的C端,W及V蛋白N端編碼區的變異發生在1-240氨基酸位點。W蛋白含有147～227個氨基酸,而V蛋白含有239個氨基酸。W和V是病毒復制的必需成分,但W基因可變性與毒力、基因型及流行年代無關[2]。

2 病毒的主要抗病毒機制

2.1.1 NDV的溶瘤機制 目前大多數的研究都集中在HN基因及其重組表達體抗腫瘤的亞臨床試驗中,但通過以上NDV基因組特點的介紹,我們發現:溶瘤作用是 HN和 F共同完成的,研究 F結構時發現,F和HN蛋白在細胞是否開始融合的關鍵部位互相制約,HN的球狀頭部結構(124位點-151位點)與F蛋白的 HRB中心部位密切結合,當 HN的球狀頭部結構與唾液酸受體接近時,HN的二聚體結構發生變化促使 F0裂解為有活性的 F,并輸送融合蛋白肽段到細胞膜表面,此時細胞融合才能夠發生[2]。形成多核巨細胞后細胞分裂停止,啟動凋亡基因導致腫瘤細胞裂解死亡。同時研究發現,NP、F或 HN基因還可直接引起了腫瘤細胞的凋亡、NP和P基因抑制了腫瘤細胞端粒酶的活性、NP和M蛋白在腫瘤細胞內的表達,抑制了腫瘤細胞的RNA、DNA、蛋白質的合成及功能或改變了DNA復制的特性,腫瘤細胞因而發生裂解[6]。

2.1.2 宿主免疫力的提高機制 據Schirrmacher[7-8]等證明,用NDV修飾腫瘤細胞制備的瘤苗,可以誘發動物及病人產生全身性的抗腫瘤免疫應答,抵抗親本腫瘤細胞株的攻擊,延長腫瘤病人的生存期限。并且證明,NDV的抗腫瘤作用與NDV顆粒表面的糖蛋白血凝素-神經氨酸酶(HN)的活性有關。HN所具有的神經氨酸酶活性,可以去除腫瘤細胞表面的唾液酸,從而增強了機體的免疫識別能力,提高了免疫細胞殺傷腫瘤細胞的作用[3]。據魏林報道,裸鼠注射 HN的重組載體對淋巴細胞,尤其是CTL細胞及N K細胞均存在較強的正向調節作用,對于打破腫瘤免疫逃逸狀態,誘發抗腫瘤免疫都是十分有利的。

通過測定全基因組序列我們可以掌握NDV的基因型即其毒力強弱,選擇出溶瘤效率最好的毒株型,同時還的考慮其致病基因型是否感染人,以及對正常細胞有無副作用,才能科學的利用F和 HN的基因序列靶向作用來治療腫瘤。

[1]唐一鳴.新城疫病毒基因組與基因演化[J].動物醫學進展,2005,26(10):1-4.

[2]Wei D,Yang B,Li Yl,et al.Characterization of the genome sequence of an oncolytic Newcastle disease virus strain Italien[J].Virus Research,2008(135):312-319.

[3]Mia Kim L,Suarez DL,Afonso CL,et al.Detection of a broad range of class I and II Newcastle disease viruses using a multiplex real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay[J].Vet Diagn Invest,2008(20):414-425.

[4]Wise MG,Sellers HS,Alvarez R,et al.RNA-dependent RNA polymerase gene analysis of worldwide Newcastle disease virus isolates representing differentvirulence types and their phylogenetic relationship with other members of the paramyxoviridae[J].Virus Research 2004(104):71-80.

[5]李太元,金寧一,丁壯,等.新城疫病毒株基因的克隆和序列分析及與國外基因的同源性比較[J].中國生物制品學雜志,2001,14(2):68-71.

[6]于健,王立冬,姜萬富,等.NP及 HN和F基因抗人喉癌的實驗研究[J].臨床耳鼻喉科雜志,2005,19(23)1082-1084.

[7]Schirrmacher V,Haas C,Bonifer R,et al.Human tumor cell modification by virus infection;an efficient and safe may to produce cancer vaccine with pleiotropic immune stimulatory properties when using Newcastledisease virus[J].Gene Ther,1999,6(1):63-73.

[8]SchirrmacherV,Ahlert T,Heicappell R,et al.Successful application of non-oncogenic viruses for antimetastatic cancer immunotherapy[J].Cancer Rev,1986,5:19-49.