糞樣中產氣莢膜梭菌的分離及cpe+菌株的鑒定

徐曉靜,孫 慶,趙李祥

產氣莢膜梭菌(C.perf ringens)是一種革蘭氏陽性、產生芽胞、嚴格厭氧及形成特殊莢膜的梭狀桿菌,是梭狀芽胞菌屬中的主要成員之一[1]。該菌廣泛存在于自然界的水源、土壤及人和動物腸道之中,主要引起人的食物中毒、氣腫疽和動物的壞死性腸炎和腸毒血癥。研究發現,該菌至少可以產生15種以上的毒素,根據產氣莢膜梭菌產生4種致死性毒素(α、β、ε、ι毒素)的能力 ,將其分為 A、B、C、D、E 5種類型[2]。

產氣莢膜梭菌腸毒素(C.perf ringensenterotoxin,CPE)是一種分子量為35 kD毒素蛋白,主要由A型產氣莢膜梭菌在芽孢期產生,是致人食物中毒的非常重要的毒力因子。美國的流行病學資料表明,cpe+產氣莢膜梭菌引起的食物中毒已占整個食物中毒病例總數的第2位。cpe基因既可位于產氣莢膜梭菌的質粒上,也可位于染色體上。當cpe基因位于細菌的染色體上時,該種CPE陽性產氣莢膜梭菌可引起人的食物中毒;而當cpe基因位于細菌的質粒上時,可分為兩種類型,即cpe-IS1470-like型質粒cpe基因、cpe-IS1151型質粒cpe基因,可分別引起人的非食源性胃腸疾病及動物胃腸疾病(如抗生素相關腹瀉和散發性腹瀉)[3]。在我國,感染產氣莢膜梭菌的病例雖然報道比較少,也缺乏詳細的統計資料,但是由于衛生條件和飲食習慣等因素,產氣莢膜梭菌也是一種不可忽視的致病菌。本研究有針對性地采集了人和動物的糞樣,對產氣莢膜梭菌進行了分離,并用生化實驗和多重PCR方法對分離菌做了系統的鑒定。

1 材料與方法

1.1 標準菌株產氣莢膜梭菌標準菌株由法國巴氏德研究所惠贈。

1.2 被檢糞樣來源 2003-2008年在江蘇省揚州市、蘇州市、南通市等地不間斷地采集糞樣。樣品包括醫院的腹瀉病人糞便,來自屠宰場的豬糞便,奶牛飼養場的牛糞和山羊屠宰交易市場的山羊糞樣等,共計1 411份。

1.3 產氣莢膜梭菌的分離與鑒定 胰蛋白胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸培養基(TSC)、硫羥乙醇酸鹽培養(FTG)均購自德國默克公司;硝酸鹽還原-動力試驗、牛奶發酵試驗、卵磷脂分解試驗、乳糖發酵-明膠液化試驗所用培養基等均按常規方法制備。糞樣的增菌處理、產氣莢膜梭菌的分離、純化與生化鑒定(革蘭氏染色、硝酸鹽還原-動力試驗、牛奶發酵試驗、卵磷脂分解試驗、乳糖發酵-明膠液化試驗)均按國標方法進行[4]。

1.4 多重PCR分型方法檢測分離菌及cpe基因的擴增 根據文其乙等的報道合成了針對產氣莢膜梭菌α、β、ε、ι、CPE 和β2等 6 種毒素的多重 PCR 引物[5]。挑取 TSC培養基上分離的單菌落,放入到含300μL去離子水的試管中,煮沸10～15 min,10 000 r/min離心5 min,取上清作為 PCR反應的模板。PCR反應按文其乙等報道的進行,每份樣品重復檢測3次。根據A型標準菌株NCTC8239的cpe基因的開放性閱讀框設計并了一對PCR引物。上游引物 :5′-TTA GGATCCA TGCTTAGTAACAATT TAAATCC-3′;下游引物 :5′-GGGGAATTCTTAAAATTTTTGAAATAA TATTGA-3′。PCR 反應體積為50μL,其中含5μL的10×PCR反應緩沖,10μL的 DNA模板,1μL的 dNTP(3 mmol/L),上、下游引物 (5μmol/L)各 1.5μL,和0.5μL的DNA聚合酶(5 U/μL),最后補加滅菌超純水至50 μL。PCR擴增條件為94℃預變性4 min,前5個循環擴增條件為94℃30 s,40℃30 s,72℃80 s,然后按94℃30 s,50℃30 s,72℃80 s的溫度轉換模式進行25個循環,在72℃延伸7 min,4℃保存。將PCR產物回收、純化后送上海生工測序。

1.5cpe+分離株中cpe基因定位 根據文獻報道[5],分別合成了引物。按所合成的引物,無論是染色體還是質粒定位的cpe均可擴增出0.6kb條帶。另外,染色體定位的cpe基因還可以擴增出特異的大小約為1.3 kb的條帶,而cpe-IS1470-like型質粒cpe基因可以擴增出特異的大小約為1.6 kb的條帶,cpe-IS1151型質粒cpe基因可以擴增出特異的大小約為0.8 kb的條帶。在50μL PCR反應中,加入終濃度為 1μM 的cpe-IS1470R1.3、cpe-IS1470-likeR1.6、cpe-IS1151R0.8和 1μMcpe-4F,及0.2μM的cpe-3F和cpe-4R引物混合物,3μL dNTP,5μL 10×PCR緩沖液和0.5μL(5 unit/μL)Taq DNA聚合酶與10 ng的DNA模板,補加超純水至50μL。PCR反應條件如下:首先94℃預變性4 min,然后按94℃30 s,61℃30 s,68℃90 s的溫度轉換模式進行40個循環,最后在68℃條件下延伸7 min。取10μL PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠中60 V電泳2 h,在紫外光下觀察結果。

2 結 果

2.1 產氣莢膜梭菌分離株分離及生化鑒定的結果從1 411份糞樣中分離、鑒定出了557株產氣莢膜梭菌,分離率達到39.5%,見表1。生化實驗顯示,分離菌能在 TSC培養基中形成黑色菌落;可以水解卵磷脂、發酵乳糖;可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,而且沒有動力,能液化明膠。

2.2 多重PCR方法對分離株毒素基因分型的結果利用多重PCR對557個產氣莢膜梭菌分離株定型。表1和圖1顯示,經鑒定本次分離到的557株產氣莢膜梭菌中有A和C兩種型:A型產氣莢膜梭菌為533株,并且包含了A型產氣莢膜梭菌的3種類型,即β2-cpe-A型產氣莢膜梭菌(泳道7),cpe+A型產氣莢膜梭菌(泳道8),β2+A型產氣莢膜梭菌(泳道9);C型產氣莢膜梭菌為24株,包含兩種亞基因型即β2-型(泳道10)和β2+型(泳道11)。本研究共分離到80株β2+產氣莢膜梭菌和一株cpe+A型產氣莢膜梭菌,沒有檢測到B、D和 E型產氣莢膜梭菌。

2.3cpe+分離株cpe基因開放閱讀框的擴增及序列確定 圖2顯示cpe+A型產氣莢膜梭菌分離株經PCR擴增,可擴增出大小約為960bp的產物,這與報道的cpeORF的大小相符。測序結果顯示分離株cpe擴增片段的核苷酸序列與標準菌株NCTC8239腸毒素基因的同源性達到99.9%,推導氨基酸同源性為100%。

2.4 多重PCR方法對cpe+分離株的cpe定位的結果 以染色體cpe+A型產氣莢膜梭菌(NCTC 8239和 NCTC 8798)、cpe-IS1470-like型質粒cpe陽性A型產氣莢膜梭菌(F 5603)、cpe-IS1151型質粒cpe+A型產氣莢膜梭菌(F 4969)作陽性對照,用多重PCR方法對cpe+產氣莢膜梭菌分離株的cpe定位。圖3顯示,本研究分離到的cpe+A型產氣莢膜梭菌擴增出0.6kb條帶和1.3kb的條帶,這與位于第二泳道的染色體型cpe+A型產氣莢膜梭菌(NCTC8239)擴增出的兩條條帶位置一致;由此可見這株cpe+A型產氣莢膜梭菌分離株為染色體cpe+A型產氣莢膜梭菌。

表1 糞便樣本中產氣莢膜梭菌的分離與鑒定Table 1 The presence ofC.perf ringensisolates from fecal samples

3 討 論

本研究是對人畜體內的產氣莢膜梭菌分布情況的一次較大規模的調查。從采樣對象上看,本研究的采樣的范圍有鮮明的特點,主要是針對我國的3種主要家畜:豬、奶牛和羊。這些動物的肉制品或乳制品即將進入食品流通市場,擺上人們的餐桌。所以,就這一點來說,本研究與人們的日常生活密切相關,具有很重要的實際意義。另外,本研究對醫院腹瀉病人的糞樣進行了檢測,即直接對患胃腸道疾病人群的產氣莢膜梭菌分布狀況進行調查,用以研究產氣莢膜梭菌與人胃腸道疾病之間的關系,因此本研究的結果也具有一定的臨床價值。調查中,奶牛糞便樣品分離率最高,為70.4%,提示我們奶牛是產氣莢膜梭菌重要的攜帶者。

多重 PCR分型的結果表明,本研究分離到的557株產氣莢膜梭菌中A型為533株,占菌株總數的95.7%;C型為24株,占4.3%。A型產氣莢膜梭菌為優勢菌群,這與國內外流行病學資料相吻合。所有分離株中,80株為β2+,占總分離菌的14.4%,與文其乙等報道的(15.0%)基本一致[5]。β2毒素是近年來最新發現的一種與動物腸道疾病有密切關系的產氣莢膜梭菌毒素[6],本研究從42株人腹瀉樣品分離菌中鑒定出10株β2毒素菌,β2毒素陽性率高達23.8%,這提示我們β2毒素與人的腹瀉等胃腸疾病有密切聯系。

CPE陽性A型產氣莢膜梭菌是引起食物中毒是重要致病因子,由該菌引起的食物中毒是3大細菌性食物中毒之一,在全球范圍內造成了巨大的經濟損失。本次調查從42株產氣莢膜梭菌人源分離株中鑒定出1株CPE陽性A型產氣莢膜梭菌,經PCR鑒定后發現cpe基因位于染色體上,而不是位于質粒上。研究表明當cpe基因位于染色體上,CPE陽性A型產氣莢膜梭菌引起人的食物中毒,而質粒源CPE陽性A型產氣莢膜梭菌可致人的抗生素相關性腹瀉和散發性腹瀉,可見該腹瀉病例可能是食物中毒病例。流行病學研究發現,平均每起CPE陽性A型產氣莢膜梭菌引起的食物中毒的暴發,通常涉及50-100人,有些嚴重的甚至涉及到上千人[7]。這表明該病例可能只是冰山一角,可能還涉及到更大范圍的食物中毒事件。隨著人們生活水平的提高,日常飲食中肉類比重越來越高。肉制品又是產氣莢膜梭菌的重要載體,因此加強肉制品中產氣莢膜梭菌的檢測刻不容緩。

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