蜱的免疫學研究進展*

鄒亞學,劉朋朋,王秋悅,付志新,賈青輝,陳麗鳳

蜱的免疫學研究進展*

鄒亞學,劉朋朋,王秋悅,付志新,賈青輝,陳麗鳳

蜱既是動物體表常見的吸血外寄生蟲,又是人和動物許多重要疾病的傳播媒介。大量的蜱叮咬宿主動物可導致宿主消瘦、貧血,同時也使動物皮革的質量降低。作為傳播媒介,蜱可傳播原蟲、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體和病毒等,不僅危害人類健康,而且給畜牧業的發展帶來了很大的經濟損失。目前對蜱的控制主要使用化學殺蟲劑。然而,隨著化學殺蟲劑的不斷使用,由此引起的負面效應也不斷暴露出來,如蜱的耐藥性,藥物的殘留及環境污染等問題,因此人們開始尋找新的生物抗蜱方法。近些年快速發展起來的免疫學控蜱方法普遍受到了國內外學者、專家的認同與重視,且通過的研究者的不斷努力已取得很大的成就。現在已有預防微小牛蜱的疫苗-TickGARDTM(抗原成分是Bm86),1994年在澳大利亞成功注冊,并且快速商業化,用戶的接受程度很高[1],這充分表明免疫學控蜱方法有極大潛力和發展前景。

1 蜱的免疫逃避機制

宿主對蜱感染的免疫包括非特異免疫和特異性免疫兩方面,兩者經常協同作用共同維持宿主動物的抗蜱免疫。趙忠芳等[2]研究表明以卡介苗作為免疫增強劑和以地塞米松與雷公藤擦劑作為免疫抑制劑,以此改變兔非特異性免疫功能,觀察不同實驗組的動物抗長角血蜱幼蟲感染的能力。結果發現非特異性免疫增強組兔對蜱抵抗力較強,與不用藥組與非特異性免疫抑制組有顯著差異,而非特異性免疫抑制組相對較弱,說明宿主的非特異性免疫和特異性免疫均對蜱發揮了免疫作用。然而蜱卻能躲過宿主的免疫防御順利的吸血,說明蜱的自身已經形成了一套繞行、偏離或者抑制等手段來逃避宿主的免疫防御系統。研究表明蜱分泌的唾液中包含了一些生物活性物質,這些物質可保證其在宿主的體表吸血過程中不被排斥。

1.1 抗凝血分子 Waxman等[3]從非洲鈍緣蜱中純化出一種強效的Xa因子抑制劑(tick anticoagulant peptide,TAP),為單鏈酸性多肽,含有60個氨基酸殘基,其中有6個半胱氨酸殘基。Joubert等[4]從蜱的唾液腺純化出了1個17ku的非競爭抑制劑,抑制Xa因子的活性,使凝血酶原不能轉化為凝血酶,抑制血液的凝固。程遠國等[5]從長角血蜱唾液腺勻漿純化出一種新的膠原特異性血小板聚集抑制因子,命名為“longicornin”,它能特異性地抑制膠原誘導的血小板聚集反應。由此可知蜱能分泌具有抗凝血作用的功能分子,從而抑制宿主的凝血反應來完成其吸血過程。

1.2 免疫抑制蛋白 1981年,Ackermanl等[6]研究發現蜱可以把進入其血腔的宿主免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)分子通過唾液腺排出體外,表明蜱有一套自我保護免受宿主抗體襲擊的機制。1994年,Wang等[7-8]研究發現蜱在吸血過程中,血淋巴及唾液腺中的宿主IgG濃度升高,然而蜱本身卻未被IgG損害,并在蜱的血淋巴和唾液腺發現了免疫球蛋白結合蛋白(immunoglobulin-binding proteins,IGBP),使得蜱對宿主的免疫逃避機制得到了進一步明確。Valenzuela[9]等在肩突硬蜱cDNA表達文庫中發現一種蛋白,命名為唾液腺抗補體蛋白(Isac),檢測cDNA中所得序列編碼的重組蛋白與天然蛋白的活性,發現蜱唾液腺與重組蛋白rIsac均可阻礙補體C3的沉積。在正常血清中存在兩種補體抑制因子,即H因子和I因子。Isac與H因子活性的作用機制相似,它抑制B因子與C3b結合,即B因子不能與C3b結合形成復合物C3bB,進而不能被裂解形成C3bBb,C3bBb可起到C3轉移酶的作用,C3轉移酶不能形成,補體旁路則被抑制,從而引起機體的免疫抑制。R.Dean Gillespie[10]等研究發現肩突硬蜱的唾液中存在一種蛋白,可與鼠和人的IL-2結合,抑制IL-2與其相應的受體結合,是IL-2的競爭性抑制劑。在宿主細胞中,IL-2是促使胰細胞成熟的生長因子,并作為一個信號分子來激活T細胞和其他帶有IL-2受體的免疫細胞,蜱唾液腺分泌物中含有的 IL-2BP(Interleukin-2 Binding Protein)可以和IL-2結合,致使T細胞和其他帶有IL-2受體的免疫細胞不能被激活發揮免疫作用,嚴重影響寄生動物的抗蜱免疫反應作用并增加病原傳播的機率。Bergman DK[11]等從安氏革蜱唾液腺中分離到了一種分子量為36ku免疫抑制蛋白(Dap36),此免疫抑制物經唾液腺分泌,存在于唾液中。RT-PCR和免疫印跡試驗表明在蜱吸血到第6d的時候Da-p36分泌量達到最大,在蜱吸血到第8d的時候將飽血蜱從宿主動物體表取下,結果顯示Dap36的分泌量顯著降低,表明Da-p36在蜱對宿主動物具有免疫抑制的作用。

2 抗蜱免疫功能性抗原的鑒定

疫苗的開發首先在于功能性抗原基因的篩選鑒定。Alger等[12]研究表明,飼喂在用斯蒂芬斯瘧蚊(Anopheles stephensi)腸抗原免疫的兔體上的蚊子的死亡率比飼喂在未經免疫或用整個蚊子的研磨物免疫的兔體上的蚊子的死亡率高,提示了人們“隱藏抗原”的存在和免疫學價值。近年來研究者們為了獲得良好的功能性抗原基因對微小牛蜱、鐮形扇頭蜱、長角血蜱、美洲花蜱、蓖子硬蜱等蜱種進行了大量的研究。其中功能性抗原的篩選主要集中在蜱的以下幾個部位:唾液腺、血淋巴、中腸、生殖腺和卵。

2.1 唾液腺 唾液腺是蜱體內最主要的功能器官。在蜱的吸血過程中,唾液腺可分泌多種具有生物活性的功能分子,在蜱叮咬吸血的同時這些分子也進入宿主的體內,誘導宿主產生免疫反應,但是這些分子在蜱的免疫逃避機制及傳播病原的過程中也發揮了重要的作用。Brown[13]首次聯合應用 SDSPAGE和免疫印跡檢測了美洲花蜱唾液腺抗原,發現了20ku抗原能誘導豚鼠抗蜱的有效免疫應答。Leboulle G等[14]從蓖子硬蜱唾液腺中表達得到了一種新蛋白,此蛋白可調節機體的抗蜱細胞免疫。Ogden NH 等[15]研究發現,自然感染蜱的免疫血清與蜱唾液腺粗提物抗原發生特異性反應,證明蜱唾液腺引起了宿主的免疫反應。劉志剛等[16]研究發現中華硬蜱唾液腺提取物經SDS-PAGE電泳顯示24條電泳帶,其中主要有6條,分子量分別為142、105、94、66、64和 56ku。用中華硬蜱叮咬過的家兔血清做免疫印跡,特異性抗原條帶為105和94ku。說明中華硬蜱的唾液腺蛋白能有效的誘導宿主產生抗體。龔海燕等[17]從鐮形扇頭蜱半飽血雌蜱唾液腺cDNA文庫的100個EST(Expressed Sequence Tag)序列中選取一個帶polyA尾的序列,命名為RhHp2。將RhHp2基因表達融合重組蛋白,用該蛋白三次免疫新西蘭兔后,發現蜱的吸血行為受到一定影響,若蜱 48h的減蟲率(上體數減少)為58%,在整個吸血過程中的死亡數增加,成蜱的飽血體重顯著降低。表明RhHp2基因的重組表達蛋白具有一定抗蜱保護作用。趙金國等[18采用PCR技術自半飽血小亞璃眼蜱雌性成蜱唾液腺cDNA表達文庫中擴增獲得了4D8基因;將其連入pMD18-T載體,構建重組克隆載體,表達并純化重組蛋白,通過免疫印跡試驗鑒定該重組蛋白是分子質量為45ku的融合蛋白,且表達產物能被半飽血小亞璃眼蜱雌性成蜱唾液腺抗原免疫血清識別。

2.2 血淋巴 Tellan R L等[19]研究發現卵黃磷蛋白的免疫血清可識雌蜱血淋巴中的一個多肽,證明血淋巴中抗蜱功能性抗原的存在。Johns等首次從硬蜱的血淋巴中分離出一個4.2 ku的抗菌肽,Lai R等[20]從希伯來花蜱雌蜱的血淋巴中分離到一種名為hebraein的新抗菌蛋白,分子質量為11 ku。

2.3 中腸 中腸是蜱體內最大的器官,具有消化和儲存養分的功能,同時蜱的中腸上皮細胞也可以和隨宿主血液吸入蜱體內的宿主抗體發上免疫反應。Willadsen等[21-22]研究發現存在于微小牛蜱(Boophilus microplus)飽血成蜱中腸提取物中一種低豐度的膜結合糖蛋白(Bm86抗原)免疫動物可以激發宿主機體對微小牛蜱的免疫保護作用,引起宿主動物體表微小牛蜱的數量減少以及飽血體重的顯著降低和產卵量的明顯減少,經氨基酸測序和反向遺傳分析獲得了截至目前最為有效的隱藏抗原—微小牛蜱的Bm86抗原基因,且利用該抗原基因成功研制了抗微小牛蜱商業化疫苗。Riding[23]從微小牛蜱的中腸分離并鑒定出保護性抗原分子Bm91,與之前Rand研制的基因工程苗Bm86聯合起來,可大大提高動物的抗蜱免疫效果。Jittapalapong S等[24]通過實驗研究蜱中腸粗提物免疫實驗動物后,結果蜱的吸附率降低,同時,蜱的生育能力也顯著下降。Nakajima等[25]對8個分泌抗體的雜交瘤細胞進行了克隆,所有的單克隆抗體都與大約76ku的中腸蛋白反應,且可以降低蜱的產卵量,證明76ku的中腸蛋白的抗蜱免疫原性。楊銀書等[26]用草原革蜱中腸組織抗原免疫家兔,分別用若蟲和成蟲叮咬被免疫的家兔,若蟲與成蟲的吸血時間分別延長33.65 h和 29.32 h,若蟲的蛻皮率減少48.33%,成蟲的產卵量減少45.72%,卵的孵化率減少34.02%。結果表明草原革蜱中腸抗原誘導機體所產生的免疫反應具有很好的蜱防制效果。

2.4 生殖腺 Weiss B L等[27]將雄蜱睪丸內28種與誘導雌蜱吸血相關基因表達重組蛋白,研究發現其中一種重組蛋白(recAhEF)可以介導雌蜱卵巢的不完全發育和唾液腺的快速退化,產卵率的降低和飽血時間的縮短,且顯著降低蜱的飽血體重高達72%,免疫動物試驗表明該重組蛋白具有良好的免疫效果。劉志剛等[28]采用LSAB免疫酶組化染色技術,對中華硬蜱特異性抗原定位進行分析;用中華硬蜱反復叮咬后的動物血清,作LSAB法抗原片染色,結果顯示:中華硬蜱唾液腺和中腸上皮呈陽性反應,而在蜱的肌肉組織、卵巢組織、血腔等器官組織均顯陰性反應,提示中華硬蜱唾液腺和中腸上皮為特異性抗原所在部位。

2.5 卵 蜱在吸血過程中卵逐漸發育成熟,卵的成熟是卵黃蛋白原(Vg)合成和釋放的結果。Friesen K J等[29]從飽血的希伯來雌蜱的卵中分離出一種Vg結合蛋白,其分子質量約為86 ku,可以預見,能針對這種蛋白發揮阻礙蜱卵成熟的方法將具有良好的控蜱效果。Tellam R L等[30]從微小牛蜱的卵中分離到44 ku-107 ku卵黃磷蛋白的復合體,用此蛋白免疫接種綿羊,可減少微小牛蜱的產卵量。

2.6 交叉抗原 趙忠芳等[31]用瓊脂雙向擴散法、酶聯免疫吸附技術和蛋白質免疫印跡技術對長角血蜱不同齡期蟲體以及越南血蜱幼蟲和微小牛蜱幼蟲之間的抗原進行了研究。研究結果表明不僅長角血蜱3個齡期蟲體之間存在共同抗原,而且與微小牛蜱幼蟲和越南血蜱幼蟲之間也存在共同抗原。趙洪斌等[32]用草原革蜱中腸抗原免疫家兔,然后用森林革蜱若蟲和雌性成蟲叮咬被免疫的家兔,森林革蜱若蟲的平均吸血時間延長 27.29 h(0.01＜P＜0.05),對該蜱成蟲的吸血時間影響無顯著性(P＞0.05),若蟲蛻皮率減少26.7%(0.01＜P＜0.05),成蟲產卵率減少41.1%(P＜0.01),卵的孵化率減少19.0%(P＜0.05)。表明草原革蜱中腸抗原誘導的免疫反應對森林革蜱具有明顯的抵抗作用,存在交叉免疫現象,這可能與草原革蜱與森林革蜱同屬于革蜱屬,遺傳距離較近,共同抗原較多有關。史志勇等[33]進行了草原革蜱(D.Nuttalli)中腸抗原誘導的免疫反應對長角血蜱(H.longicornis)的交叉免疫抵抗研究,表明草原革蜱中腸抗原誘導的免疫反應對長角血蜱若蟲與成蟲的吸血時間、若蟲蛻皮率無顯著影響,但能使成蟲的平均產卵量減少33.42%,卵孵化率降低17%。表明草原革蜱中腸抗原誘導的免疫反應對長角血蜱具有一定程度的交叉免疫抵抗作用,兩種蜱可能存在共同抗原成份。

由上述可知同種蜱不同齡期之間存在著交叉抗原,不同種蜱之間也存在有交叉抗原,這些研究為抗蜱功能性基因的篩選提供了基礎資料,提示著我們篩選抗蜱功能性抗原的篩選原則應該是篩選共同抗原,提高抗蜱疫苗的廣譜性。

3 結 語

蜱功能基因的篩選鑒定將極大促進抗蜱疫苗的開發研制,在蜱的免疫研究中,如何采用更先進的生物技術獲得有效的疫苗候選抗原,擴大抗蜱種類范圍,了解蜱的生物學特性以及從分子角度更深入地闡明有關機理,是需首先解決的課題,而“雞尾酒”式廣譜抗蜱疫苗,是將來研制蜱疫苗的趨勢。

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R384.4

A

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陳麗鳳,Email:chen_lifeng@163.com

河北科技師范學院動物科技學院,秦皇島 066000

2010-10-24;

2011-03-21