惡性瘧原蟲多藥抗性蛋白pfMRP1研究新進展*

徐淑慧(綜述),楊照青

近幾年在瘧疾的治療中,抗瘧藥抗藥性的產生成為瘧疾控制的最大難題,隨著分子生物學技術的發展,從分子水平上研究惡性瘧原蟲的抗藥性的產生取得了重大突破性進展,惡性瘧原蟲多藥抗性蛋白pfMRP1(The P.falciparum M ultid rug Resistance Protein 1)被認為是和多種藥物抗性產生有關的ABC轉運蛋白,與抗瘧藥抗性的產生有密切關系。

1 惡性瘧原蟲多藥抗性蛋白pfMRP1與ATP結合盒式蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC蛋白)

在瘧疾的治療中,瘧原蟲尤其惡性瘧原蟲抗藥性的產生,嚴重影響了瘧疾的有效控制,瘧原蟲抗藥性產生的潛在機制是復雜多因的,導致抗藥性產生的最重要的因素是藥物到達不了它的靶點,這歸因于瘧原蟲基因組中有一種活性物質轉運蛋白,我們叫它多藥抗性蛋白(MDR/MRP),大部分多藥抗性蛋白屬于A TP結合盒式蛋白[1](ATP-binding cassette transporter,ABC蛋白),ABC蛋白是一個古老而龐大的蛋白質家族,是一類A TP驅動泵。1976年首次有文獻報道ABC蛋白是癌癥藥物治療中對多種天然藥物產生抗性中表現為170 kDa P-糖蛋白,后來,轉染實驗提供了確切的證據,在哺乳細胞中第2次發現ABC蛋白的過表達與腫瘤細胞的多藥抗藥性(MRP)密切相關,是導致化療失敗的主要原因,約 40%的患者的癌細胞內該基因過度表達[2]。ABC轉運蛋白主要包括P-糖蛋白、多藥抗藥相關蛋白和乳腺癌抗藥蛋白,它們屬于同一家族,具有保守的功能結構域和多樣化的生物學功能。MRPs多藥抗性轉運蛋白是其中一種,能利用水解ATP的能量將各種藥物從細胞質內轉運到細胞外,這個新的分類定義了多藥抗性蛋白(MRPs).在體內和體外研究中指出了它和抗藥性的相關性[3-4]。

已經確定的惡性瘧原蟲ABC蛋白質超家族有16個成員,其中11個被認為是藥物流出轉運蛋白,現在展開的P f ABC基因系統分析法把ABC超家族分為7個亞科群,亞科B是最大的,包含有7個成員,別的和藥物轉運有關的家族成員有P f ABCC1,P f ABCC2、P f ABCG1和 P f ABCI3 。決定 ABC轉運蛋白的表達和定位的轉運蛋白有3個P f MRP1,P f MRP2,和P f MDR5,存在于無性繁殖階段的寄生蟲的細胞膜上[5]。這些活躍在蛋白質膜上的特殊物質可以泵出很多在結構和功能上不同的兼性藥物,從而減少細胞內的藥物聚集,導致藥物產生抗性。

ABC蛋白的典型結構包括6個跨膜片段形成的跨膜區(TMD)的和w alker A和walker B基序形成的核苷酸結合區(NBD),ABC蛋白也編碼完全轉運體(TMD-NBD-TMD-NBD)或部分轉運體(TMD-NBD),用來轉化結合一個功能單位[6],其中pfMRP1和pfMRP2是完全轉運體,P f MDR5是半轉運體。除它的正常生理功能之外,近年發現,ABC蛋白廣泛存在于多種正常的組織和器官,參與藥物和內、外源毒素的吸收、分布和排泄,行使解毒和防御保護的作用。

2 pfMRP1在抗瘧藥中的作用

p fMRP1在抗瘧藥中的作用是近幾年瘧疾研究中的重點,pfMRP1的蛋白質編碼PFA 0590w,(http://p lasmodb.org/)由 1 822個氨基酸組成,HMMTOPv2軟件分析pfMRP1的二級結構由12個雙螺旋結構構成,分布在兩個跨膜區(MSDs),在NDB附近形成典型短的MRP[4],幾個已經確定的突變位點都位于 pfMRP1基因的功能區MSDs,NBDs附近,位于這些區域可以控制它的底物特異性和增加ATP結合水解蛋白的能力[7],這些結構的天然變異提示pfMRP1具有不同的轉運能力,最近有文獻報道更進一步表明,pfM RP1的分解降低了瘧原蟲把氧化廢物轉運出細胞的能力,使瘧原蟲對周圍的環境敏感性增加,體外研究中也發現使瘧原蟲對氯喹,奎寧,青蒿素,哌喹和伯氨喹的敏感性增加[4],臨床藥效試驗中發現I876突變在蒿甲醚-本芴醇(AL)治療后復發的病例中的選擇性,K 1466突變在磺胺多辛-乙胺嘧啶(S-P)治療后復發的病例中的選擇性[8],而且,在抗瘧藥體外試驗中發現,pfMRP1的突變可以降低所有藥物敏感性,除了咯萘啶,所有這些研究有力的說明了pfMRP1和幾種結構不相關的抗瘧藥都有關,由此推理了抗瘧藥的抗藥性機制,尤其揭示了當前以青蒿素為基礎的綜合治療(ACT)的抗藥性機制,pfM RP1是青篙素和ACT其他成員的產生交叉抗性的基礎。在氯喹和奎寧的體外研究中揭示了pfMRP1的轉運機制,可以將各種藥物從細胞質內轉運到細胞外,從而降低細胞內的藥物濃度,使細胞對藥物產生抗藥性[4]。MRPs有個特殊的機制影響藥物的抗性,就是通過增加物質量對抗藥物轉運,這尤其對藥物的特異性靶點有作用,這一機制在抗葉酸素的研究中普遍存在[9]。

最近研究還表明,pfMRP1轉運抗瘧藥和細胞膜上氧化型谷胱甘肽(GSSG)轉運有關,通過對大量受捐者誘導氧化應激實驗,可以得出在惡性瘧原蟲中pfMRP1起著一個重要的GSSG流出泵作用,這種泵作用也可以在人類MRPs中觀察到[10],這揭示了pfMRP1具有多樣化的生物學特性。

3 pfMRP1單核苷酸多態現象對不同藥物的特異性

pfMRP1有個重要的功能是可以降低氯喹、奎寧、青蒿素的敏感性,它的多態現象增加了所有蛋白質的轉運功能從而降低了所有相關藥物的敏感性,也可以通過降低蛋白質的轉運效率而增加藥物的敏感性,除了S-P,pfMRP1多態現象對S-P的選擇性不大,這一觀點在乙胺嘧啶和青蒿素的抗藥性研究中已經得到證實,pfMRP1多態現象介導了青蒿素和ACT中當前運用的其他藥物的交叉抗性,增加一種藥物的pfM RP1的活性可以降低ACT成員中所有藥物的敏感性,包括本芴醇,甲氟喹和阿莫地喹[4],這是當前瘧疾治療的最大難題。

這里有三個因素解釋我們觀察到的不同的突變位點影響不同藥物的敏感性的原因,盡管這些都是pfMRP1的潛在轉運功能。(1)最重要的因素是pfMRP1有藥物特異性,即使MRP的酶結合位點有重疊,突變位點只是有助于有些酶的結合,而不是所有酶的結合,導致了核苷酸多態性只和特定藥物有關系。(2)可能pfMRP1在甲氟喹和本芴醇在細胞質靶點中的作用比在食物泡的靶點靶點更重要,氯喹,阿莫地喹也是這樣。(3)有些藥物可以誘導氧化應激反應,pfMRP1的附加效應轉運GSSG,把細胞從氧化壓力下解救出來[11],轉運GSSG和藥物有不同的酶結合位點[4]。

4 pfMRP1,pfMDR1和pfCRT在抗藥性產生過程中的協同作用

pfMRP1潛在影響抗藥性方面和其他惡性瘧原蟲膜轉運體有協同作用,比如惡性瘧原蟲多藥抗性基因 PfMDR1和惡性瘧原蟲氯喹抗性相關基因P f CRT。

PfMDR1是食物泡膜的輸入者,逆方向影響藥物轉運,野生型突變位點和基因擴增可以降低甲氟喹,本芴醇和青篙素等藥物的敏感性,而會增加氯喹和阿莫地喹的敏感性,甲氟喹,本芴醇在食物泡外面有它的靶點[12],PfMDR1對食物泡的轉運效率可以通過各自的靶點降低這些藥物的敏感性,相反的,PfMDR1在比較低的轉運效率情況下可以增加氯喹和阿莫地喹的敏感性,這可能是因為它的靶點在食物泡內部的原因。

P f CRT是食物泡膜的輸出者,最初是在氯喹的抗藥性中發現的,P f CRT的天然76T突變比野生型的突變有更好的轉運能力,P f CRT可以使藥物從食物泡中溢出,這將降低氯喹和阿莫地喹的敏感性,當P f CRT返回到它的作用部位,到甲氟喹和本芴醇的靶點,又會增加甲氟喹和本芴醇的敏感性。

pfMRP1以相同的方式影響大多數藥物,它對抗瘧藥物轉運的影響是顯而易見的,直接作用于細胞膜和細胞質。但它可以通過P f CRT對藥物的活動,進一步作用于食物泡藥物的靶點[13],可見,這幾種抗藥性基因共同影響藥物的抗藥性。

5 pfMRP1基因突變的類型特點和基因突變的檢測方法

在對pfMRP1基因的研究中,目前確定的多態性(SNPs)一共有4個,這幾個點突變導致編碼氨基酸的密碼子發生改變,分別為 Y 191H和A 437S,I876V和K 1466R,這幾個突變位點位于蛋白質功能區附近(特別是NBDs)[3]。pfMRP1有顯著的生物多樣性,一些已經確定的多態性有地域性的特點。在非洲的瘧疾感染樣本中,I876V和 K 1466R的突變比較常見,K 1466R突變只有在非洲和新幾內亞島樣本中檢測到,I876V突變現象遍及全球瘧疾流行區,在亞洲和大洋洲的樣本中最常見的突變位點是Y191H和A 437S[14],這2個位點的突變率很高。

對pfMRP1基因突變的檢測最直接和有效的方法就是進行DNA測序分析,各大洲的惡性瘧分離株上的突變位點都是通過這種方法發現的[15]。但是若對待測樣本全部進行DNA測序,成本較高,無法廣泛應用,針對 Y191H和A 437S,I876V和K 1466R這幾個突變位點在惡性瘧原蟲抗藥性中的關鍵作用,如果能夠檢測到這一位點的突變與否,就能初步判該株惡性瘧原蟲是否為抗性株。這就需要設計特定引物通過PCR擴增出包含這幾位氨基酸密碼子的DNA片段進行分析,目前國外已經有報道通過巢式PCR法擴增出包含這幾個突變位點密碼子的DNA片段[9],再通過特異性的限制性內切酶進行酶切的限制性長度多態性分析(RFLP),通過酶切片段的不同來判斷是否存在基因突變 。巢式PCR法是用兩套引物(內、外引物)作兩輪PCR,第1輪PCR擴增出一段較長片段,作為第2輪PCR的模板再進行擴增,使用巢式引物進行多輪擴增提高了PCR反應的特異性和靈敏度,這樣可以提高實驗結果的可信度和可靠度。

6 結 語

pfMRP1在瘧疾抗藥性產生中發揮很重要的作用,我們可以通過分子生物學技術,掌握它的生物多樣性的特點,對位于MSDs,NBDs功能區附近的突變位點進行研究,檢測出各個瘧疾流行區對特定藥物的敏感性,指導臨床用藥及新的抗瘧藥的研制,降低藥物產生抗性的概率,控制瘧疾的流行和傳播。

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