西尼羅病毒診斷的研究進展*

付鈺廣,任巧云,羅建勛,殷 宏

西尼羅病毒(West Nile Virus,WNV)首次于1937年12月在烏干達西尼羅地區的一名發熱成年女性血液標本分離到,屬黃病毒科(Flavivirdae)黃病毒屬(F lavivirus)的乙型腦炎病毒血清群。可導致人類西尼羅熱(West Nile Fever)或西尼羅腦炎(West Nile Encephalitis)。發病者常常出現發燒、頭痛、皮疹、淋巴結腫大等癥狀,嚴重時表現為無菌性腦膜炎,甚至死亡。該病毒在自然界的傳播循環為鳥-蚊-鳥,人和馬可作為其偶然宿主[1],除受感染蚊蟲叮咬外,也可通過輸血、器官移植、哺乳及母嬰垂直傳播引起人與人之間的傳播。西尼羅病毒在全球的分布比較廣泛,主要分布于非洲、中東、西亞和歐洲南部的一些國家。在1999年首次傳入西半球的美國紐約,至2003年導致美國數十個州近萬人感染和數百人死亡,從而引起了全球衛生界的普遍關注。

該病毒目前存在Ⅰ和Ⅱ兩種譜系,譜系 Ⅰ分布廣泛,已確認與人類疾病有關,譜系Ⅱ主要分布于非洲。病毒核酸為不分節段的單股正鏈RNA,全長為10 000～11 000bp,編碼3種結構蛋白:病毒殼蛋白(C)、前膜蛋白(preM)、包膜蛋白(E)和七種非結構蛋白:NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b 和NS5[2]。E蛋白為西尼羅病毒最重要的抗原結構蛋白,介導病毒與宿主結合,能刺激機體產生相應抗體,是決定病毒毒力的決定性蛋白。在電鏡下觀察病毒粒子呈球形,有包膜,顆粒直徑為40～60 nm,核衣殼呈20面體對稱。該病毒對脂溶劑、尿素、消毒劑、消化酶均敏感,紫外線照射、56℃加熱15 m in可使病毒滅活,保存該病毒最佳的條件為pH8.4～8.8,-60℃。

西尼羅病毒的主要傳染源為處于病毒血癥期的帶毒動物,和該病毒的自然儲存宿主-野鳥,傳播該病毒的蚊子主要包括庫蚊、伊蚊和曼蚊,特別是尖音庫蚊將病毒傳播給人。蚊子因叮咬感染WNV的鳥類而帶毒,然后帶毒的蚊子通過叮咬將西尼羅病毒傳播給人和其他物。西尼羅病毒能穿過血腦屏障,干擾正常的中樞神經系統功能,臨床上主要表現為腦炎或腦膜腦炎。西尼羅病毒病主要發生在晚夏或早秋,氣候常年溫暖地區四季均可發生。

目前,針對西尼羅病毒感染尚無有效的治療方法,真正用于預防西尼羅病毒的疫苗主要為滅活疫苗,且僅限于在馬群中應用。迄今我國雖還無西尼羅病毒的報道,但隨著我國國際往來日益頻繁,西尼羅河病毒被攜帶入境的可能性越來越大,存在著極大的傳入隱患,且現在該病毒在全球迅速傳播的機制還未研究清楚,因此掌握快速診斷該病毒的檢測方法,是及早發現并阻斷該病毒暴發的重要手段。

目前對該病的診斷有多種方法,可以用人和動物的組織、腦脊髓液、血清或全血以及蚊子作為診斷材料,通過血清學、病毒學、組織病理學檢查和流行病學進行診斷。本文就西尼羅病毒的各種診斷方法的最新研究進展進行闡述并探討其發展趨勢。

1 血清學檢測

血清學檢測一直是診斷西尼羅病的最主要的方法,主要包括:IgM抗體捕獲酶免疫法(MACELISA)、間接免疫熒光試驗(IFAT)、血凝抑制試驗(HI)和蝕斑減少中和試驗(PRNT)。

1.1 ELISA方法 該方法可檢測血清中IgM和IgG抗體,此兩種抗體檢測方法最有效的為捕捉IgM的MAC-ELISA檢測方法,感染WNV后IgM的免疫應答出現的比IgG早,MAC-ELISA不但可用來檢測血清中或大腦脊髓液中的WNV的IgM[3],而且MAC-ELISA方法具有快速、高敏性且能定量等優點,所以此技術可用于感染WNV的早期診斷。該方法是現有檢測血清和腦脊液中病毒抗體最敏感的篩檢方法。

在多數公共衛生實驗室MAC-ELISA方法已取代了補體結合實驗和血凝抑制試驗,因為在急性感染黃病毒的早期診斷中其敏感性最高,在患病8 d內時檢測敏感性高達 90%[4]。據報道 MACELISA在檢測患者的腦脊髓液和血液樣品時其敏感性高于PCR[5]。因為在健康個體病毒會很快的被免疫系統清除,所以在出現臨床癥狀時一般不會檢測到病毒核酸。對患者來說 MAC-ELISA是一種更加合適的檢測方法,目前在美國,MAC-ELISA是運用最廣泛的診斷WMV腦炎的技術。

MAC-ELISA也有其一些局限性:第一,盡管人對WNV和其他黃病毒的IgM應答針對病毒特定類型比IgG較高,但與黃病毒屬的日本腦炎病毒血清群存在交叉反應。有實驗證明,用該方法檢測(抗原分別來自以下三種病毒)已經確診為西尼羅河病毒、圣路易斯腦炎病毒和日本腦炎病毒感染的人血清共103份,其中36份西尼羅河病毒血清有6份與圣路易斯腦炎病毒抗原、19份與日本腦炎病毒抗原發生交叉反應;32份圣路易斯腦炎病毒血清有20份與西尼羅河病毒抗原,7份與日本腦炎病毒抗原發生交叉反應;35份日本腦炎病毒血清有1份與圣路易斯腦炎病毒抗原,11份與西尼羅河病毒抗原發生交叉反應;在美國的研究中,一般采用蝕斑減少中和實驗鑒別西尼羅河病毒與圣路易斯腦炎病毒引起的感染。說明該方法作為黃病毒的篩檢,不能作為確診。第二,在IgM檢測時登革熱和黃熱病也會出現交叉反應。另外了解患者一些其他的信息:例如歷史上WNV或其他黃病毒活躍的地區,對解釋診斷結果可能會有幫助;第三,患者血清包含的未感染WNV的IgM分子可以與WNV的IgM分子非特異性競爭,可導致MAC-ELISA的敏感性降低。第四,類風濕因子可與M AC-ELISA方法發生非特異性結合會導致假陽性結果的出現,這種類風濕因子可能出現在健康個體的血清中,因此可能會混淆血清學診斷。

1.2 間接免疫熒光試驗(IFAT) 間接免疫熒光試驗可用于疑似WNV感染的血清中抗WNV的IgG、IgM 或總抗體(IgG+IgA+IgM)的檢測,此方法費時需2～3 d完成。此方法用于檢測抗體,是一種有效、快速、經濟的黃病毒診斷方法,是一種特異性較高的病原體鑒定方法[6],美國2000年從新澤新洲采集的1 705份野鳥血清用ELISA方法篩選,30份為陽性,其中有12份采集到了野鳥的腎臟組織,用免疫熒光技術檢測,12份全為陽性,ELISA對照為陰性的樣品檢測亦為陰性,但是該方法敏感度偏低,而且需要制備相應的熒光抗體,還要用熒光顯微鏡鏡檢,因此不能用于大量患者血清檢測;又由于腦脊液中IgM的濃度比血清中低1000倍,所以此方法亦不能用于腦脊液中IgM的檢測。

1.3 血凝抑制試驗(H I) 早在1954年Casals和Brown就開始使用血凝抑制試驗方法[7]。H I方法的效價比中和試驗高,但是其效價和陽性樣品比PRNT低。H I方法可檢測IgM 和IgG的抗體級別,但其敏感性較ELISA低得多。當保存長時間時H I所用的試劑穩定性較其他方法所用試劑的穩定性差,目前此法已被M AC-ELISA方法所取代。

1.4 蝕斑減少中和試驗(PRNT) 蝕斑減少中和試驗是WN的血清學診斷的金標準,有著較高的靈敏度和特異性,一般通過其他血清學檢測篩選的陽性樣品必須通過特異的蝕斑減少中和試驗來進行確診,此方法可以鑒定特異的黃病毒抗體,可對兩種抗原性相關的病毒的感染進行鑒別。在蝕斑減少中和試驗中發現以恢復期血清較急性期IgG抗體滴度高4倍以上的為陽性[8]。

蝕斑減少中和試驗在WNV感染的診斷中很有價值,而且是特異性最強的血清學檢測方法,但它依然有著許多局限性。首先中和試驗不能區分IgM和IgG,很難判定中和試驗檢測的是現階段抑或是既往感染,另外空斑減少中和試驗也需要細胞培養以及活的病毒和嚴格的測試病毒滴定,其次該方法操作復雜,耗時耗力(檢測WNV需要6天時間),不適用于大量樣品的檢測。

早在2002年美國疾控中心(CDC)就開始研究鑒別西尼羅河熱病毒、日本腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒感染的IgM ELISA抗體檢測技術,研究證明西尼羅河熱病毒的prM蛋白與乙腦的抗血清不發生交叉反應,說明p rM蛋白在西尼羅河熱的鑒別診斷中有著很好的應用前景[9-10]。但因為PRNT和MAC-ELISA這兩種方法要用活病毒進行試驗,限制了它們在非疫區國家的使用。

2 病毒的分離鑒定

通常用于病毒分離的標本有患者的腦脊液、處于病毒血癥的血清(持續5d左右)、腦組織,馬的腦和脊髓組織,鳥的腎、腦和心臟組織。分離病毒的方法一般為乳鼠腦內接種法和細胞培養法[11],細胞培養分離病毒時多用的是對西尼羅河病毒敏感的哺乳動物細胞系如Vero細胞或蚊子細胞系,美國的衣阿華州獸醫實驗室從紐約動物園中感染發病的智利火烈鳥采集樣品,通過 Vero細胞培養得到NY99西尼羅河毒株。病毒分離后,應用間接免疫熒光試驗、核酸檢測或中和試驗加以確證。如用腦脊液和血清作為標本分離病毒時,因為病毒血癥時間短(持續5 d左右),病毒滴度低,分離陽性率低,一般用急性期血清接種Vero細胞單層,4-7 d后根據細胞病變和免疫熒光確定。

病毒分離法是檢測病毒的經典技術,是診斷病毒感染的“金標準”,對于新發疾病病毒分離和病毒的自然宿主是非常有價值的工具,但此法要求條件高,分離率低,操作復雜,所需時間長,不能夠快速,大量的進行病毒診斷。

3 核酸診斷

核酸檢測快速準確,操作簡單,敏感性高,特異性強,已廣泛用于各種疾病的檢測,現已研制出了幾種針對與西尼羅病毒核酸的檢測方法,并得到了廣泛的應用,主要有反轉錄-聚合酶鏈式反應(PTPCR),反轉錄-巢式聚合酶鏈式反應(PT-nPCR),實時熒光定量反轉錄PCR(Real time RT-PCR),依賴核酸序列的擴增技術(nucleic acid sequence-based am plification,NASBA)。

3.1 常規PT-PCR 美國疾控中心建立了檢測西尼羅河病毒的標準PT-PCR,此法可用于檢測西尼羅河病毒感染的人、鳥和蚊等樣品,因為該標準方法可從日本乙型腦炎中擴增出非特異性條帶,在用此法檢測出陽性樣品時,要注意鑒別這兩種病毒,有研究人員實驗證明通過產物的RFLP分析可以做到鑒別這兩種病毒。Lanciotti和同事們根據西尼羅河病毒的C蛋白基因和preM基因建立的檢測西尼羅河病毒的RT-PCR法,此法缺點在于特異性上與黃病毒有交叉反應,敏感性上在人腦脊液、血清和馬組織樣品中檢不出病毒[12]。在我國,如鄧永強等建立了檢測西尼羅河病毒的一步RT-PCR法,是根據病毒的E基因設計引物,經過驗證此法適用于實驗室檢測和流行病學檢測[13]。張久松等根據C-preM蛋白基因設計引物建立了檢測西尼羅河病毒的的常規RT-PCR法,經證明此法可以用于檢測媒介蚊蟲和動物宿主組織中的西尼羅河病毒[14]。雖然有多種RT-PCR檢測方法在生產實踐中廣泛應用,但是此法有著自身的局限性,其敏感性有限,因此國內外又建立了敏感性更強的反轉錄巢式PCR(RT-nPCR)。

3.2 RT-nPCR 由于美國疾控中心所建立的標準RT-PCR不能從馬腦組織病料中擴出特異性條帶,為此,美國農業部動植物檢疫局建立了以西尼羅病毒E基因為擴增區的RT-nPCR,提取病毒 RNA后,進行2次RT-PCR,可以從感染的馬腦組織中檢出西尼羅病毒,此法現已定為馬西尼羅病感染毒的標準方法.美國相關實驗室也開發建立了檢測西尼羅病毒的標準RT-nPCR方法。國內如鄧永強等以E基因為擴增區建立的檢測西尼羅病毒的一步RTPCR和巢式RT-PCR方法,二者分別檢測不同稀釋度的乳鼠腦懸液和Vero細胞上清,后者的敏感度分別是前者的104和102倍,敏感性得到提高[15]。張久松等以E基因建立的RT-nPCR和以C-p reM基因建立的RT-PCR,在檢測蚊蟲模擬標本和乳鼠腦病毒液中的西尼羅河病毒基因,敏感性前者比后者分別提高了108和109倍。現建立的檢測西尼羅河病毒的巢式RT-PCR具有較高的敏感性和特異性,為西尼羅河病毒的流行病學調查奠定基礎。

3.3 Real time RT-PCR 由于巢式反轉錄PCR的自身限制性,操作步驟多,增加了實驗室污染的機會,容易出現假陽性結果,不利于大規模的流行病學調查,且不能夠大程度的實現快速、大量、準確的檢測,因此國內外發展建立了檢測西尼羅河病毒的實時熒光定量RT-PCR。此技術是近年來發展起來的新技術,包括 TaqM an探針、SYBRG reenⅠ熒光染料、雜交探針、分子信標等幾種方法,具有快速、敏感、污染少等特點。美國疾控中心建立了兩套引物的TaqMan探針實時熒光定量RT-PCR用于檢測西尼羅河病毒,一套引物只適用于檢測與西尼羅河病毒NY 99株高度同源的毒株,另一套可檢測出所有的西尼羅河病毒毒株[16]。Lanciotti等建立了TaqMan探針 Real-time RT-PCR法可以快速檢測人、蚊子和鳥組織中的西尼羅河病毒,且敏感性比常規RT-PCR高10倍。在國內,如陳曉等以E基因建立的一步法TaqM an探針實時熒光定量 RTPCR,可以特異性檢出西尼羅河病毒,不與日本腦炎病毒發生交叉反應,切不易出現污染引起的假陽性結果[17]。唐泰山等以E基因和3′-UTR非編碼區,建立的WN YC和WN YA TaqM an探針Real-time RT-PCR法,具有高的敏感性和特異性,可以作為檢測西尼羅河病毒的技術儲備[18]。從多樣性的樣品中檢測病毒,Real-time RT-PCR是一種快速可靠的方法,TaqM an探針法可檢測到0.1PFU量的病毒RNA,敏感性很高。SYBR G reen實時熒光定量PCR檢測法也已經建立,與TaqM an探針法相比敏感性相同,但成本低,可以檢測出更多的西尼羅河病毒的變種[19],此法適合于大規模的的診斷和流行病學調查。

3.4 NASBA 其又稱為自主序列復制技術,由Guatelli于 1990年首次提出,NASBA技術是在PCR基礎上發展起來的一項連續、等溫的體外核酸擴增反應體系,反應終產物是與模板RNA互補的單鏈RNA,并有兩種檢測單鏈RNA的方法,一種為NASBA-電化學發光分析法,另一種為NASBA-信標分析法,該技術適合于單鏈RNA的檢測及測序。美國CDC已指明此法可作為一種診斷方法用于實驗室診斷,并已建立了這兩種檢測西尼羅河病毒的方法,通過實驗證明NASBA-電化學發光分析的敏感性比NASBA-信標分析要高,且NASBA分析法的敏感性和特異性比RT-PCR和TaqM an法更高。Lanciotti等人建立了NASBA-電化學發光分析法和NASBA-信標分析法兩種用于檢測人腦脊液、蚊蟲和鳥組織中西尼羅病毒,有著比上述幾種基因檢測方法更高的敏感性和特異性。NASBA法特異性強、敏感性高、操作簡單,所需時間短,適合于大規模的檢測診斷。

用常規 RT-PCR、TaqM an熒光定量 PCR、NASBA-電化學發光分析法和NASBA-信標分析法同時檢測從10 000 pfu的 NY 99毒株10倍稀釋到0.01pfu,可檢測到得病毒量依次為1pfu、0.1pfu、0.01p fu和0.1p fu,結果說明在西尼羅河的檢測中NASBA-電化學發光分析法具有更高的敏感性,經試驗證明NASBA方法有著更高的特異性。美國疾控中心(CDC)已指明NASBA方法可用于西尼羅河熱病毒的實驗室檢測。

此外,還有研究人員建立了多重PCR的檢測方法,用于檢測西尼羅病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒和亨德拉病毒引起的腦炎。Parida等建立了以E基因為擴增區的檢測西尼羅病毒的一步RT-LAMP法,該法較之其他核酸檢測方法更特異、靈敏、快速且無需熱循環儀,在恒溫條件下進行核酸的擴增,而且可與其他檢測方法相結合,提高檢測的敏感性[20]。

4 結 語

任何診斷方法都有其優缺點,診斷WNV的方法也是如此,因此可根據具體情況靈活運用上述診斷方法并結合患者臨床癥狀、病例剖檢和流行病學調查綜合判斷。

[1]張小龍.蚊一鳥一蚊循環在西尼羅病毒傳播中的作用研究[D].北京:中國人民解放軍軍事醫學科學院,2007.

[2]Lanciotti R S,Ebel GD,Deubel V K,et al.Complete genome sequences and phylogenetic analysis ofW est Nile virus strains isolated from the United States,Europe,and the M idd le East[J].Virology,2002,298(1):96-105.

[3]Beaty BJ,Calisher CH,Shope RE.Diagnostic procedures for viral,rickettsialand chlamydial infections[J].A rboviruses,1995,7:204-205.

[4]Diamond M S.Progress on the development of therapeutics against West Nile virus[J].Antiviral Research,2009,83:214-227.

[5]Briese T,G lass WG,LipkinW I.Detection of w est nile virus sequen ces in cereb rospinal fluid[J].Lancet, 2000,355:1614-1615.

[6]宋捷.西尼羅病毒套式PT-PCR和實時熒光PT-PCR檢測方法的建立[D].南京:南京農業大學,2007.

[7]Casals J,Brow n LV.H em agglu tination with anthropod-borne viruses[J].JExp Med,1954,99:429-449.

[8]楊艷菊.西尼羅河病毒 E蛋白結構域 III的原核表達及其特異性單克隆抗體的研制[D].揚州大學學報,2006.

[9]Martin DA,Biggerstaff BJ,A llen B,et al.U se of immunoglobulin M cross-reactions in differentialdiagnosis of human flavivirus encephalitis infections in the United States[J].C linicaland Diagnostic Laboratory Immunology,2002,9(3):544-549.

[10]Cardosa MJ,Wang SM,Sum MSH,et al.An tibodies against prM protein distinguish betw een previous infection with dengue and Japanese encephalitis viruses[J].BMC M icrobiol,2002,2(1):9-14.

[11]杜堅,孫虹,馬洪波.西尼羅病毒實驗室診斷[J].中國國境衛生檢疫雜志,2005,28(6):344-348.

[12]Lanciotti RS,Kerst AJ,Nasci RS,et al.Rapid detection ofW est Nile virus from human clinical specimens,field-collected mosquitoes,and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay[J].JC lin M icrobiol,2000,38(11):4066-4071

[13]鄧永強,姜濤,范寶昌,等.西尼羅病毒的 RT-PCR檢測與鑒定[J].微生物學免疫學進展,2004,32(4):31-35.

[14]張久松,張泮河,左曙青,等.西尼羅病毒 RT-PCR檢測方法的建立及其初步應用[J].中國人獸共患病雜志,2004,20(9):737-74.

[15]W ong M L,M edrano JF.Real-time PCR form RNA quan titation[J].Biotechniques,2005,39(1):75-85.

[16]Shi Pei-Yong,Kauffm an EB,Ren Ping,et al.High-throughput detection of West Nile virus RNA[J].JC lin M icrobiol,2001,39(4):1264-1271.

[17]陳曉,增志磊,朱丹,等.Real-time RT-PCR檢測西尼羅病毒一步法的建立[J].中國人獸共患病學報,2008,24(12):1107-1110.

[18]唐泰山,宋捷,田玲玲,等.西尼羅病毒熒光 RT-PCR檢測方法的建立[J].中國人獸共患病學報,2008,24(8):732-735.

[19]Papin JF,Vahrson W,Dittm er DP.SYBR green-based realtime quantitative PCR assay for detection of West Nile V irus circumvents false-negative results due to strain variability[J].J Clin M icrobiol,2004,42(4):1511-1518.

[20]Parida M,Posadas G,Inoue S,et al.Real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amp lification fo r rapid detection ofWest Nile virus[J].JC lin M icrobiol,2004,42(1):257-263.