噬菌體技術用于結核病診斷的研究進展*

王 偉,羅泰來,柏銀蘭

2.第四軍醫大學微生物學教研室,西安 710032

噬菌體技術用于結核病診斷的研究進展*

王 偉1,羅泰來2,柏銀蘭2

2.第四軍醫大學微生物學教研室,西安 710032

結核病是一種主要由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)——少數為牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌感染而引發的危害嚴重的傳染病。據WHO統計,全球約1/3的人口感染MTB,每年新增患者900萬,并有300萬人死于該病。因此,盡早、及時地診斷出結核患者,不僅能及時治療結核患者,也有利于結核病的控制。目前,結核病診斷主要依靠實驗室診斷、影像診斷以及臨床體癥相結合的方法,實驗室診斷主要包括抗酸染色涂片法、培養法,另外還有血清學診斷方法[1]和分子生物學診斷等方法[2]。但是這些方法的檢測特異性不高,難以區分MTB潛伏感染和非結核分枝桿菌感染[3],且報告時間難以滿足臨床快速診斷的需要[4]。噬菌體技術用于MTB的研究已有50多年歷史。近年來,大量研究發現噬菌體可以用于MTB鑒定及細菌藥物敏感性測定,由于噬菌體檢測M TB具有報告時間短、特異性較高等特點,因而在早期診斷方面引起研究者的廣泛關注。

1 噬菌體檢測 噬菌體是一類細菌病毒,分為毒性噬菌體及溫和噬菌體。前者可在敏感宿主菌內增殖,并使之裂解;后者基因組整合于宿主基因組中,成為細菌DNA的一部分,不單獨復制。噬菌體由于與宿主菌的關系具有高度特異性,因此常用于細菌分型、轉導,也可以利用基因重組技術構建熒光報告噬菌體[4-5]。噬菌體生長快、侵染特異性高,最快的檢測可以在24 h內觀察到明顯的結果,平均檢測時間為2 d[4]。而MTB檢測“金標準”細菌培養法檢測需要至少8 w的時間,因此噬菌體檢測技術具有快速、廉價、操作簡便、技術要求低的優點,其總準確度可以達到 80%以上,且很少出現假陽性結果[6]。

2 分枝桿菌噬菌體株 用于MTB研究的新發現和新人工構建分枝桿菌噬菌體株很多,毒性噬菌體株有 TM4、D29、DS6A 、I3,其中 TM4 和 D29 較為常用,侵染效果較好;溫和噬菌體株有 L1、L5等,主要用于構建熒光報告噬菌體[11]。常見的熒光報告噬菌體中,phAE40是第一代由TM4衍生出的毒性熒光報告噬菌體,其檢測敏感性較高,能檢測出104/mL的活細菌[5];phGS18基因型與L5同源,對恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)具有更高的敏感性,但很少用于侵染MTB[8];phBD8由D29衍生,使用較少。

3 噬菌體擴增裂解法及其檢測 噬菌體擴增裂解法(phage amplified biologically assay,PhaB)首次由Wilson[5]等提出,其原理是利用空斑形成實驗檢測MTB。噬菌體侵染細菌后在宿主細胞內增殖,最終裂解細胞,若觀察到噬菌斑則說明噬菌體已經侵染了細胞,表明標本中存在MTB。

檢測方法:采集患者標本如痰液、尿、腦脊液、胸水、腹水,將標本進行去污染和殺滅雜菌的預處理,接種,37℃培養24h使標本MTB擴增[9]。然后將菌液與噬菌體液混勻37℃孵育1h,使特異性噬菌體感染、裂解標本中的MTB,然后加高度特異的殺病毒劑室溫靜置5min,清除所有未進入MTB細胞內的噬菌體。隨即添加敏感細胞,加培養基制成瓊脂板,37℃18～24h后觀察結果。如果待檢標本中不含MTB,噬菌體則會被殺病毒劑消除,故敏感細胞不被感染,最終無噬菌斑出現[10]。檢測實驗中為了提高準確性和敏感性,采取了2次侵染的方法。先讓噬菌體侵染細菌,然后用殺病毒劑滅活細菌胞外的噬菌體;再用已測定過可以被噬菌體侵染的敏感細胞來測試,確定細菌中裂解出的噬菌體不是環境污染帶來的。

PhaB起初應用于臨床檢測MTB對利福平、異煙肼和喹諾酮的耐藥性[5,11,22],逐漸也用于檢測MTB對乙胺丁醇、異煙酰胺、鏈霉素和環丙沙星的抗藥性[9]。由于PhaB檢測技術特異性高而且方法簡便迅速,在檢測方面逐漸受到了廣泛關注。Shriprakash Kalantri[12]等收集了2000年以來的Medline、EMBASE 和Web of Science and Biosis上的文獻,對PhaB應用于MTB在臨床樣本檢測的精準度作了全面的統計學分析。在痰涂片陽性的樣本中,靈敏度為29%～87%,特異性為60%～88%;在痰涂片陰性樣本中,靈敏度為13%～78%,特異性為89%～99%。分析結果表明,噬菌體裂解檢測法有高度的特異性(≥83%),總準確性略高于涂片鏡檢,但靈敏度不太穩定(21%～88%),對高濃度M TB標本的檢測較為可靠。因此,如何提高噬菌體檢測技術的敏感性,以滿足臨床實際應用是相關研究者關注的主要問題。

4 熒光報告系統 在MTB感染的最初階段,短時間的菌血癥就可以引起活菌在體內擴散[13],導致潛伏感染[14]。而PhaB難以檢測到潛伏感染的數量極少的活菌,Azger Dusthackeer[11]認為可能是噬菌體裂解細菌造成了AT P的迅速分解,釋放了能量,影響了實驗的敏感性。熒光報告系統(luciferase reporter phages,LRP)是人工重組噬菌體,重組基因能表達熒光素酶蛋白(reporter fire fly luciferase,FFlux)。噬菌體在M TB內增殖后,噬菌體表達的熒光酶作用于底物外源性熒光素和內源性ATP,產生可以檢測到的熒光。LRP法不需要裂解宿主菌,因此常用溫和噬菌體。采樣,預處理后接種培養MTB 24 h,用 LRP侵染MTB,然后用熒光測量儀檢測。通過測定發光強度可以檢測待檢分枝桿菌是否繁殖,這種方法大幅度提高了檢測的靈敏性。在過去的幾十年研究中LRP檢測方法一直表現出極大的可發展性,因此有可能在早期潛伏感染的診斷中得到廣泛應用。

5 噬菌體檢測技術進展 影響噬菌體檢測技術的因素主要有兩方面:采樣、送檢過程中的操作不當;實驗過程中實驗條件、方法不完善。研究發現,由于噬菌體侵染的是活MTB細胞,因此病人樣本的采集時間和送檢過程若是存在影響MTB活細胞數目的因素,將對檢測結果造成影響。及時送檢檢測敏感性可以達到80%左右,而送檢不及時可能造成敏感性只有30%左右[12]。臨床標本采集的影響可通過制定相應的規范和對采集者培訓等途徑減小,做到早期無菌取樣、及時送檢。因此噬菌體檢測技術的改進主要集中于實驗材料、侵染條件和實驗方法的探索。

5.1 噬菌體侵染和復制條件 Ruth McNerney[10]認為,要獲得最大的檢測敏感性,優化噬菌體侵染和復制的條件是必要的。在使用雙鏈DNA噬菌體D29感染BCG的過程中發現,在37℃7H9培養基中30 min內發生侵染,可以檢出100 CFU/mL的陽性結果,而在陰性樣品中沒有假陽性出現。研究發現,優化侵染和培養時間能得到較高的敏感性,在最佳條件下經過1 d培養的樣品陽性率(65%)顯著高于未經過預培養的樣本(40%)[15],培養樣本20～24 h后檢測或是取同一病人的多份樣品檢測也可以提高敏感性[10]。另外,大量實驗發現,要獲得最佳的MTB檢測效果,胞外噬菌體的滅活應該控制在最大程度侵染完成后到細胞裂解前這段時間里。細胞溶解發生在135～150 min左右,因此用殺病毒劑,如FAS等滅活噬菌體應在半小時以后,但不能超過兩小時。

5.2 噬菌體侵染最適滴度 上海肺病醫院[15]應用PhaB作了關于痰樣本檢測試驗條件的研究,發現低濃度的MTB使用高濃度的噬菌體侵染效果較好,37℃200～500/mL的M TB用 1×109PFU/mL的噬菌體侵染60min即可完成檢測。Ruth McNerney[7]實驗發現,噬菌體滴度保持在107～108PFU/mL能獲得較好的侵染效果。在梯度濃度的噬菌體侵染MTB實驗中發現,低濃度的噬菌體并不會造成顯著的侵染效率降低,但當噬菌體濃度達到107PFU/mL時,其感染效率與104PFU/mL相比呈幾何倍數上升;高濃度下,特別是當濃度超過108PFU/mL時,能明顯觀察到噬菌斑減少,原因可能是產生了頓挫感染,因為大量的噬菌體顆粒同時侵入細菌造成了細菌胞壁的損壞,因而在子代噬菌體產生之前細菌已成為不能給病毒提供復制條件的非容納細胞[22]。

5.3 溫敏噬菌體 采用 DNA重組技術對現有分枝桿菌噬菌體進行改造,是噬菌體檢測技術研究的新領域。Phage88是重組的溫敏LRP,在分枝桿菌噬菌體TM4的非必須區插入含FFlux表達基因與卡介苗hsp60啟動子的融合體,37℃噬菌體停止增殖。檢測結果表明,BCG的發光值最高,恥垢分枝桿菌次之,MTB最低。檢測MTB H37Ra敏感性達到6.4×104個/mL,檢測 MTB H37Rv敏感性達到7.6×104個/mL[16]。雖然phage88的特異性和敏感性已經得到了較大提高,但目前尚局限于實驗室藥物篩選,應用于臨床早期診斷還需要更進一步的研究。

5.4 使用強啟動子噬菌體 Svetoslav Bardarov[14]改進了LRP檢測方法,構建了一種帶有強啟動子lef t的重組體phAE142。phAE142是將phAE85的啟動子hsp60替換成了溫和噬菌體L5的啟動子lef t,從而獲得了高敏感性。實驗發現,同滴度下,phAE142產生熒光強度是phAE85的10～100倍,而檢測需要的時間縮短了2/3,這說明phAE142有更好的感染性。phAE142與MGIT儀器培養法的同條件比較中發現,phAE142檢測的MTB滴度不能小于0.5～1×108CFU/L,在平均滴度109CFU/L下能進行快速、準確的MTB檢測和藥敏試驗[18]。在用phAE142檢測培養陽性的20例樣本的試驗中,噬菌體檢測法僅未檢測出兩例低滴定度的樣本,但其檢測時間僅有2 d,而MGIT需要1w左右。

5.5 檢測M TB休眠菌 Azger Dusthackeer[7]等利用phAETRC16和phAE159構建了3種LRP重組體:phAETRC21、phAET RC201 和 phAETRC202,都獲得了高敏感性,可以檢測處于休眠狀態的桿菌。phAETRC16由M TB溫和噬菌體Che12衍生,攜帶hsp60啟動子;溫敏噬菌體phAE159由 TM4衍生。phAETRC21是 phAETRC16的衍生株,由啟動子icl啟動FFlux基因。phAET RC201和phAET RC202都是phAE159的衍生株,分別由啟動子hsp60和acr啟動FFlux基因。

研究表明,在溫敏噬菌體TM4的衍生菌中表達熒光酶基因能增加熒光量,從而提高檢測的敏感性。MTBH37Rv檢測試驗中,重組體phAE159和phAET RC16檢測敏感性分別為4×104和5×105,重組體 phAETRC21、phAET RC201和 phAETRC202檢測敏感性分別為6×105、8×101和2×104。臨床樣本的檢測試驗中,phAE159和 phAETRC16檢測敏感性分別為 6×105和1×107,重組體 phAETRC21、phAET RC201 和 phAET RC202分別為1×107、1×105和1×106。結果表明,phAETRC201和phAET RC202重組體對MTB有更高的敏感性,并在24h左右檢測到了熒光。研究認為,TM4衍生株特有的TMP(tape measure protein)蛋白中的MT3模體可能是增加熒光量的原因。

5.6 藥物聯用 MTB檢測中,非結核分枝桿菌感染、其他細菌的污染或者HIV感染都會造成實驗敏感性和特異性的偏差。因此在合適的實驗條件下進行噬菌體檢測,要獲得穩定和高度的敏感性,應盡量避免實驗中的污染。Albert H[19]利用藥物輔助噬菌體檢測作了相關試驗,在M TB培養時加入一種抗微生物制劑NOA(含制霉菌素50 000IU/L、苯唑西林2mg/L、氨曲南30mg/L),不會對 MTB生長、感染有影響,但對其他雜菌有較好的抑制效果。結果發現,FAST Plaque檢測法的敏感性和準確性有顯著提高,并且NOA與利福平等抗癆藥物沒有交叉影響。

5.7 噬菌體檢測試劑盒 FASTPlaqueTB試劑盒是近年來商品化的一種噬菌體檢測試劑盒,其基本原理是噬菌體擴增裂解法,對噬菌體、反應中各試劑以及各步反應時間進行優化。Ayman Mohamed Marei[6]將 FASTPlaqueTB與鏡檢、PCR的對照比較,實驗中采用Actiphage作為特異性噬菌體,比較結果顯示,FASTPlaqueTB、抗酸染色和PCR的特異性分別為 95%、95%、91%。研究證明,FASTPlaqueTB檢測達到了臨床檢測的標準,在尿樣檢驗中FASTPlaqueTB檢驗結果有更高的應用價值,其靈敏度、特異性和總精準度分別達到64%、93%和84%。FASTPlaqueTB檢查法由于其快速(可以當天出結果)、廉價且試驗結果明顯的特性[20],將有可能替代 PCR和培養法作為臨床診斷的重要方法之一[14]。

6 展 望

結核病是目前全世界死亡率僅次于艾滋病的感染性疾病,在結核病流行地區,常由于不能盡早發現結核患者,因此無法有效的控制結核病的傳播、蔓延[17]。噬菌體檢測技術具有快速、簡便、特異、準確、作用譜狹窄、技術要求低、不需特殊的儀器設備等特點,大大縮短了結核病的診斷周期,在早期診斷中可以作為檢測的重要指標。同時,該方法能初步確定患者是否為活動性結核患者、潛伏感染者,在抗結核效果快速評價方面也具有十分重要的意義[14]。

針對噬菌體基因組的重組改造還在不斷地探索中,目前噬菌體檢測方法還沒有統一的標準體系[4]。利用抗微生物制劑抗污染,以及通過改良實驗方法提高檢測準確性,這兩方面是當前研究主要集中的部分。可以預見,隨著分子生物學和基因工程技術不斷發展成熟,噬菌體基因組改造將日趨完善,檢測敏感性將更加穩定。在結核分枝桿菌快速檢測、結核病早期診斷方面,噬菌體技術具有較大潛力。

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R378

A

1002-2694(2011)08-0738-04

*國家“十一五”重大傳染病專項基金(2008ZX-10003-013)和國家自然科學基金(30500432)聯合資助

柏銀蘭,Email:amay0001@sina.com.cn

1.第四軍醫大學藥學系,西安 710032;

2010-11-21;

2011-03-19