急性淋巴細胞白血病復發與p16蛋白表達缺失之間關系的臨床研究

鄭 喆

(遼寧省沈陽市第四人民醫院血液內科，遼寧 沈陽 110031)

1 病例與方法

1.1 病例來源

2004年4月至2010年8月在沈陽市第四人民醫院內科血液系門診就診、住院的急性淋巴細胞白血病（ALL）患者40例，其中：男26例，女14例，中位年齡：25歲。對所有患者均按FAB分型診斷標準進行確診。并以確診為缺鐵性貧血25例、巨幼細胞性貧血15例，作為對照組患者40例，其中男21例，女19例，中位年齡39歲。

1.2 分組

根據急性淋巴細胞白血病患者就診時的血Rt，WBC計數是否高于20×109/L來分組：①高白細胞組：WBC＞20×109/L，有24例；②低細胞組：WBC＜20×109/L，有16例。③對照組：確診為單純性貧血的患者，無WBC計數升高或降低，共40例。按急性淋巴細胞白血病的就診狀態來分組：初診組5例，完全緩解組6例，復發組29例。

1.3 檢測方法

1.3.1 測定p16蛋白表達值

對40例急性淋巴細胞白血病患者做骨穿，采集其少許骨髓樣本。采用APAAP方法檢測：用淋巴細胞分離液分離出單個的淋巴細胞，用1640液洗滌，制成細胞懸液，滴片后放入-20℃的冰箱里保存，備用。（對40例確診為單純性貧血的患者做骨穿時另外留取少許骨髓樣本，也做這個測定，作為對照組）。用博士德生物制品公司生產的免疫組化試劑盒來做免疫組化檢測，記錄結果。

1.3.2 p16蛋白表達是否缺失的檢測標準

當受檢淋巴細胞內出現較多的棕色顆粒，即：該棕色顆粒占細胞內所有顆粒的25%以上時，則為陽性表達——不缺失，（正常）。當受檢淋巴細胞內的棕色顆粒較少，即：棕色顆粒占細胞內所有顆粒的25%以下時，則為陰性表達——低表達；表達缺失，（異常）。

1.4 統計學處理

1.5 研究設計類型

該調查設計屬于回顧性調查研究類型；實驗設計屬于成組設計類型。

2 結 果

2.1 對照組和ALL不同病期患者的p16蛋白表達缺失值不同

①對照組：單純性貧血者40例，他們的p16蛋白表達值，均為陽性表達；②急性淋巴細胞白血病（ALL）不同病期患者組40例患者的p16蛋白表達值，均為陰性表達，其中，初診組患者的p16蛋白表達缺失值為10%～21%，復發組患者的p16蛋白表達缺失值為2%～5%，完全緩解組患者的該值為19%～25%，并且，ALL初診組、復發組的p16蛋白表達缺失值顯著低于對照組、完全緩解組的p16蛋白表達缺失值，（P＜0.01）；ALL完全緩解組的p16蛋白表達值與對照組的陽性表達值的差異無顯著性（P＞0.05）。

2.2 動態檢測15例ALL患者的p16蛋白表達缺失值

檢測、觀察15例ALL患者從緩解期到復發期的演變過程中的p16蛋白表達缺失值的變化，發現他們的p16蛋白表達缺失值在26.8%～4.3%之間，很明顯，ALL復發期的p16蛋白表達缺失值低于ALL完全緩解期的p16蛋白表達缺失值，（P＜0.01）。在骨髓細胞形態學確診15例ALL患者復發之前1個月時的p16蛋白表達缺失值就都顯著低于其在完全緩解期時的該指標了。直到臨床醫師確診其復發時，此p16蛋白表達缺失值已達高峰值。

2.3 初診、ALL復發未治組患者部分臨床特征與p16蛋白表達缺失值之間的關系

①WBC＞20×109/L組的p16蛋白缺失值低于WBC＜20×109/L組的p16蛋白缺失值；②肝脾腫大組的p16蛋白缺失值也明顯低于無肝脾腫大組的p16蛋白缺失值。因P＜0.05，故其差異有統計學意義。提示：WBC＞20×109/L組、肝脾腫大組患者的p16蛋白缺失值均顯著降低。

3 討 論

急性淋巴細胞白血病（ALL）是惡性淋巴細胞在骨髓、外周血和其他器官克隆性增殖的一種異質性疾病，占急性白血病發病率的30%～40%[1]。

近年來，隨著血液病臨床醫學的發展，使得急性淋巴細胞白血病的基因學理論與臨床研究理論相結合的水平得到提高。

人們發現：p16蛋白來自p16基因，p16基因是一種新型的重要的抑癌基因，它位于細胞核染色體的9P21的位置上，是細胞核G1/S期相互轉換的關鍵性的調控基因。在正常人體組織中，p16基因可以使人體骨髓產生p16蛋白，這種蛋白可以抑制細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）4和6的作用，該基因可以競爭細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）4和6的（即CDKS）的活性，可以直接抑制細胞增殖[2]。測定在骨髓的正常狀態——p16抑癌基因沒有失活的情況下的 p16蛋白表達值，其正常值應為陽性表達值。

而急性淋巴細胞白血病者和急性淋巴細胞白血病復發患者，其p16基因發生突變，使p16抑癌基因失活，迫使淋巴細胞內的細胞核p16基因轉錄、翻譯等調控機制失活，引起骨髓內的淋巴系造血干細胞的核染色體的細胞分裂周期加速，使G1期縮短，特別是在DNA還沒有修復之前就使核染色體的細胞分裂過早地進入S期，導致p16第1外顯子和（或）第2外顯子甲基化[3]。這種甲基化重復發生，即過度甲基化，就勢必引起骨髓內的淋巴造血干細胞p16基因競爭性抑制細胞周期蛋白依賴性激酶4和6（CDKS）的作用，使得抑制細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）4和6的功能衰減，從而引發p16抑癌基因蛋白缺失，因此，使p16抑癌基因不能直接抑制骨髓內的淋巴造血干細胞的增殖，導致癌性淋巴細胞過度增生——增殖失控。這就是為什么使急性淋巴細胞白血病患者骨髓不能產生這種p16蛋白，使在臨床上測定p16蛋白表達缺失值時，常常表現為低表達或表達缺失（陰性表達）的根本病因機制所在，這可能就是淋巴細胞發生惡性轉化（克隆）的關鍵。p16抑癌基因失活和p16抑癌基因蛋白表達缺失，必將導致ALL患者骨髓液p16蛋白表達為低表達或表達缺失，即導致急性淋巴細胞白血病的復發。

人體內p16抑癌基因失活能夠引發p16蛋白表達缺失，這一機制在急性淋巴細胞白血病（ALL）復發機制中起著重要的作用。一些研究證明：慢性粒細胞白血病（CML）在發生急淋變的前3個月時間里就已發生p16抑癌基因失活，如果在這個期間里為其檢測p16蛋白表達值，它則顯示為表達缺失，表示該患已經發生急淋變。即通過測定p16蛋白表達值，就可以預測慢性粒細胞白血病患者是否已發生急淋變[4]。聯合檢測不同標本的p16基因甲基化，可以提高肺癌診斷的敏感性[5]。

檢測急性淋巴細胞白血病患者的p16蛋白表達值就是檢測其體內p16抑癌基因過度甲基化的程度，從而可以檢測到該患病程是否已進入到復發階段。

上述臨床研究表明：對照組和ALL不同病期患者p16蛋白表達（缺失）值不同；急性淋巴細胞白血病（ALL）不同病期患者組的p16蛋白表達值，均為陰性表達；動態檢測15例ALL患者的p16蛋白缺失值，發現ALL復發期的p16蛋白表達缺失值顯著低于ALL完全緩解期的該值；WBC＞20×109/L組、肝脾腫大組患者的p16蛋白缺失值均顯著降低。而確診為單純性貧血患者的p16蛋白表達值，均為陽性表達。

對ALL完全緩解后患者進行動態監測p16蛋白表達缺失值；動態做血Rt檢查，觀察WBC計數是否其高于20×109/L、WBC分類中淋巴細胞百分比值、絕對值是否異常升高，來輔助判斷其病情的輕重。通過動態測定ALL患者p16蛋白表達值、血Rt這兩項結果，進行觀察分析，則將十分有利于醫師盡早地判斷急性淋巴細胞白血病患者是否已經復發、是否具有復發趨勢，做出確定診斷，以便使醫師能及時地對其采取有效的治療措施，挽救其生命。同時，因為這兩項檢查易于被患者接受，故其具有廣闊的臨床應用前景。

在新推薦的診斷標準中，檢測真性紅細胞增多癥（簡稱“真紅”）高發JAK2基因突變，已被當作“真紅”診斷的一個重要指標。更有人建議真性紅細胞增多癥高發JAK2基因突變方面的檢測，可作為篩選真紅的重要方法，從而不需要進一步做骨髓活檢和血液學參數等項檢查了[6]。而急性淋巴細胞白血病是比“真紅”更厲害的惡性克隆性造血干細胞疾病，因此，對急性淋巴細胞白血病患者開展測定p16蛋白表達值是否缺失或者低下，也可作為篩選急性淋巴細胞白血病是否復發的重要方法。

在血液內科臨床實踐中，醫師對白血病，尤其是對急性白血病患者應當持續地開展p16蛋白表達缺失值和血Rt的聯合檢測，這對醫師及時地診斷患者是否為急性淋巴細胞白血病、盡早確診某急性淋巴細胞白血病患者是否已經復發；（慢粒白血病是否已發生急淋變），都必將起著舉足輕重的作用。

[1] 顧敏,李艷,秘營昌,等.Ph染色體陽性急性白血病38例臨床分析[J].中國實用內科雜志,2009,29(7)：641.

[2] Tutor O,Diaz MA,Ramirez M,et al.Loss of heterozygosity of p16 correlates with minimal residual disease at the end of the induction therapy in non-high risk childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia[J].Leuk Res,2007,26(9)：817-820.

[3] 陳文明,張文藝,朱嘉芷,等.急性白血病患者P16及P15基因純合子缺失及甲基化研究[J].中華血液學雜志,1999,20(9)：474-476.

[4] 許多榮,洪文德,童秀珍,等.P16基因異常與慢性粒細胞白血病關系的研究[J].中華血液學雜志,1999,20(11)：602-603.

[5] 胡灼君,劉大鷹,胡宏波,等.P16基因甲基化聯合檢測在肺癌診斷中的意義[J].中國實用內科雜志,2009,29(1)：50-52.

[6] 張連生.基因突變與真性紅細胞增多癥[J].中國實用內科雜志,2009,29(5)：421.