堿性pH條件下白念珠菌鈣離子通道CCH1和MID1基因對鈣內流的影響及Crz1p轉錄因子對其的調控作用

王慧，徐寧，邢來君，李明春，魏東盛

南開大學微生物學系 分子微生物學與技術教育部重點實驗室，天津 300071

鈣離子是微生物細胞生長必須的營養元素之一，并且在細胞內充當著重要的第二信使分子的角色[1-2]。真核生物細胞對外界環境變化的適應能力對其存活至關重要，酵母細胞在暴露于多數環境壓力時，如：離子饑餓[3]、高等滲壓力[4]、堿性 pH[5]以及其他信號分子 (如α-因子[6]和藥物胺碘酮[7]) 等，都會引起胞內鈣離子濃度的瞬間變化。細胞內鈣離子濃度的變化機制極其復雜，可能是外鈣內流的結果，也可能是胞內鈣庫，如液泡或高爾基體釋放鈣離子的結果。Brand等發現鈣離子通道 (VGCC) 電壓門控膜蛋白Cch1p和Mid1p，與白念珠菌鈣內流有關[8]。胞外鈣離子通過Cch1p和Mid1p進入細胞內，引起細胞內鈣濃度的瞬間變化進而激活鈣調神經磷酸酶 (CaN)，使得轉錄因子 Crz1p去磷酸化，與CDRE (CaN依賴性的應答元件) 結合來進一步激活下游的應答基因，隨后將胞內的鈣離子濃度降低到變化前的水平[5]。

微生物體必須在環境變化的適應過程中存活，這對于人體條件致病性真菌白念珠菌尤為重要。pH是一種重要的生理環境壓力條件，對白念珠菌的形態有顯著影響，細胞對環境pH的適應能力對其致病性至關重要[9]。酵母細胞內鈣離子的動態平衡與pH密切相關，在釀酒酵母中對堿性pH轉錄應答的研究首次給出鈣離子信號轉導途徑介導 pH壓力應答的證據。DNA微陣列數據[10]表明在堿性pH條件下，共有150個pH依賴性的基因在mRNA水平上表達上調至少2倍。堿性pH條件誘導的許多基因的表達在CNA1/CNB1或CRZ1基因缺失的菌株中下調，甚至在添加CaN的免疫抑制劑藥物FK506時完全受到抑制。對 ENA1啟動子元件分析的結果表明，在其中有2個pH應答區，包含著最小的CDRE元件，來激活堿性pH條件引發的轉錄應答。可見，以鈣離子信號作為信使，轉錄因子 Crz1p介導的鈣信號途徑是pH壓力應答中的重要途徑。

為了研究鈣信號途徑在堿性 pH條件應答中的重要作用，本文構建了鈣通道基因 CCH1和 MID1的缺失突變株，研究其在堿性pH條件下對鈣內流的影響。微生物細胞胞內鈣濃度變化的測定方法很多，其中鈣發光蛋白指示法[11]有過多次報道，然而很少使用流式細胞術來檢測酵母細胞中鈣離子的變化。本文利用流式細胞術在全細胞水平上測定堿性 pH條件下胞內鈣波變化的動力學，分析CCH1和MID1缺失對鈣內流的影響，通過 β-半乳糖苷酶體系和實時定量PCR方法進一步追蹤Crz1p轉錄因子的調控作用。總之，對鈣信號途徑的研究將有助于加深對白念珠菌堿性pH應答機制的了解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

Taq、Taq plus、long Taq DNA聚合酶、常用限制性內切酶購于 TaKaRa公司；限制性內切酶BspQⅠ、NogM Ⅳ和 AseⅠ購于 NEB公司；pGEM-T Easy Vector、T4 DNA連接酶及反轉錄酶購于 Promega北京生物技術有限公司；DNA快速純化/回收試劑盒、M199培養基、ONPG和dNTPs等購于北京鼎國生物技術有限公司；轉化使用試劑PEG3350、LiAc以及鈣離子螯合劑EGTA和鈣探針Fluo-3AM購于Sigma公司；熒光定量PCR使用天根公司的 SYBR-Green試劑盒。其余試劑均為國產分析純；所有引物均由北京奧科公司合成。

1.1.2 菌株、質粒和引物

實驗使用的菌株和質粒見表1，引物見表2。

1.1.3 培養基

LB培養基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl。白念珠菌培養使用的所有培養基(SC-ura除外) 均添加終濃度80 μg/mL尿苷。YPD培養基：1%酵母浸出粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖。SC培養基：0.67%無氨基酵母氮源，0.2%省卻混合物粉末，2%葡萄糖。M199培養基：M199粉末一袋，150 mmol/L HEPES，80 μg/mL尿苷，調溶液的pH至 4或 8，抽濾除菌。鈣離子螯合劑 EGTA配成100 mmol/L貯液，過濾后添加到培養基中使終濃度達到10 mmol/L，形成鈣離子缺陷的培養條件，CaN的免疫抑制劑FK506配成1 mg/mL貯液，添加到培養基的終濃度為1 μg/mL，CaCl2配成1mol/L貯液，添加時終濃度為200 mmol/L。

表1 本研究使用的菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.2 白念珠菌基因的敲除

使用二步法PCR介導的基因敲除的方法[12]。分別以質粒 pRS-Arg?SpeI和 pDDB57為模板，MID1/CCH1-5DR和3DR為引物，通過PCR獲得含有ARG4或URA3選擇性標記的PCR產物。將PCR產物直接轉化野生型菌株 DAY1。白念珠菌細胞的轉化使用醋酸鋰法，具體方法參見文獻[13]。使用MID1/CCH1-5detect和3detect引物通過PCR的方法進行轉化子的鑒定。

1.3 Fluo-3熒光染料負載及流式細胞術測鈣

離心收獲對數生長期的細胞，用 HBSS緩沖液(氯化鉀0.4 g/L、氯化鈉8.77 g/L、六水合氯化鎂0.2 g/L、氯化鈣 0.22 g/L、HEPES 2.38 g/L、葡萄糖1.98 g/L，pH 7.0) 洗滌細胞，熒光染料Fluo-3AM貯液用20% Pluronic F-127 DMSO溶解至濃度為1 mg/mL，使用時終濃度為5 μg/mL。加染料的細胞置于37 ℃避光孵育50 min，負載后用HBSS洗滌細胞3次。使用FACSCalibur流式細胞儀測定胞內鈣離子濃度，在加入刺激物質前，鈣離子的熒光值平穩，顯示為基線，30 s后加入KOH或HCl，混勻流式管中的細胞后跟蹤細胞內鈣離子的動態變化482 s，總時間為512 s。數據使用Winmdi 2.9軟件進行分析。

1.4 pPHO89-LacZ-His重組質粒的構建

使用PHO89-Pdistal和PHO89-ATG引物擴增得到PHO89啟動子，終質粒pPHO89-LacZ-His的構建方法參見文獻[14]。

1.5 β-半乳糖苷酶活性測定

轉化不同菌株的 pPHO89-LacZ-His質粒，在SC-His缺陷培養基上篩選正確轉化子，將轉化子接種于30 mL不同條件的M199培養基中，30 ℃振蕩培養至OD600≈0.8~1.0時收集菌體，β-半乳糖苷酶活性的測定具體步驟見文獻[13]，β-半乳糖苷酶的活性計算公式，OD420×1 000/[OD600×t (min)×3(稀釋因子)]，單位為Miller，每組數據的獲得均來自至少3次獨立平行實驗。

1.6 白念珠菌總RNA提取

將白念珠菌接種至3 mL M199 (pH 7) 培養基中，30 ℃過夜振蕩培養。稀釋過夜培養的菌液，轉接至50 mL M199 (pH 4或pH 8)培養基中，起始OD600≈0.1，30 ℃振蕩培養至 OD600≈0.6~0.8，離心收集菌體，洗滌后液氮凍存。使用玻璃珠破壁的方法提取RNA[15]。提取的RNA樣品保存于?80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.7 cDNA的合成和熒光定量PCR

使用Promega公司的Oligo(dT) 引導cDNA第一鏈的合成，反應程序為：37 ℃，30 min使引物結合；42 ℃、1 h進行反轉錄；70 ℃、15 min滅活反轉錄酶。反轉錄得到的cDNA樣品在?80 ℃保存，熒光定量PCR使用Bio-rad IQ5儀器，ACT1-5RT和ACT1-3RT引物用于ACT1的擴增，MID1-5RT/3RT、CCH1-5RT/3RT引物分別來擴增MID1和CCH1基因，每個反應設4個平行。PCR擴增條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，68 ℃ 30 s，40個循環。PCR完成后，溫度從58 ℃升至94 ℃，儀器自動收集熒光信號，得到融解曲線。進行 3次獨立平行實驗后，使用Bio-radIQ5軟件分析實驗結果，計算MID1和CCH1的Threshold cycle (Ct值)，使用內參基因ACT1的Ct值矯正目的基因的Ct值得到 ?Ct值，然后進一步比較野生型菌株和缺失突變株中同一基因的 Ct值得到 ??Ct值，基因相對表達量使用2???Ct方法計算[16]。

2 結果

2.1 白念珠菌CCH1和MID1基因缺失突變株的構建

CCH1和MID1基因雜合缺失突變株比較容易獲得，挑取 SC-Arg選擇性平板上的轉化子，分別提取基因組DNA，進行轉化子的PCR鑒定。結果顯示：對于CCH1，篩選的14個轉化子中，有11個出現3.8 kb的CCH1基因野生型條帶和2.3 kb的ARG4條帶 (圖1A，泳道3)，獲得雜合子的陽性率為78.6%。對于MID1，篩選的21個轉化子中，有17個出現1.7 kb的MID1基因野生型條帶和2.4 kb的ARG4條帶 (圖1B，泳道2)，獲得雜合子的陽性率為 80.9%。但是純合突變株不易獲得，第 2次重組后大部分轉化子是由 URA3替換了 ARG4造成的雜合突變株，從SC-Ura平板分別篩選了75個CCH1和80個MID1的轉化子，僅獲得1株純合突變株cch1::ARG4/cch1::URA3 (圖1A，泳道1) 和mid1::ARG4/mid1::URA3 (圖1B，泳道3)，陽性率分別為1.33%和1.25%。

圖1 CCH1和MID1基因缺失突變株的PCR檢測Fig. 1 PCR confirmation of CCH1 and MID1 mutants. (A) 1: NKC73 (cch1::ARG4/cch1::URA3); 2: wild type; 3: NKC72 (cch1::ARG4/CCH1). (B): 1: wild type; 2: NKC67 (mid1::ARG4/MID1); 3: NKC68 (mid1::ARG4/mid1::URA3); M: marker Ш 4.5 kb, 3.0 kb, 2.0 kb, 1.2 kb, 800 bp from top to bottom.

2.2 堿性 pH 條件引起胞內鈣離子濃度的瞬間變化以及CCH1和MID1基因缺失對鈣波變化的影響分析

經Fluo-3AM負載的細胞上流式管，圖2A為白念珠菌DAY1細胞FSC/SSC散點圖，圖中細胞最為集中的R1區域設定為研究范圍。野生型白念珠菌細胞受到3 mol/L KOH刺激后，由于胞內的pH由中性變為堿性，200 s內即可看到明顯的鈣峰出現，而在250 s后胞內鈣離子濃度又回到刺激前的基線水平(圖2B)。使用6 mmol/L的HCl刺激同樣的細胞，使胞內 pH由中性變為酸性，卻沒有明顯的鈣峰出現(圖 2C)。為了進一步研究 pH對胞內鈣波變化的影響，使用不同濃度的KOH和HCl刺激DAY1細胞，比較每一種 pH條件下鈣波變化區域的平均熒光強度值與最大變化區域值的比值來確定能引起鈣波變化最為顯著的pH條件范圍。從圖2D可以看出，當胞外pH達到7.5時，比值大于50%，證明開始出現了較為明顯的鈣波變化并且在pH 8.2時達到最大，在pH 8.5后，這種變化又逐漸減弱，表明不同pH引起的胞內鈣離子濃度的瞬間變化是劑量依賴性的。我們使用同樣濃度的 KOH刺激 cch1?/?和mid1?/?細胞 (圖2E、2F)，使胞內的pH達到8.2，但并沒有看到明顯的鈣峰出現，表明CCH1和MID1基因缺失影響了堿性pH條件下鈣離子的內流。

圖2 不同pH條件下鈣波變化的動力學及cch1?/?和mid1?/?對堿性pH條件下鈣內流的影響Fig. 2 Kinetics of the calcium fluctuation in response to different pH and effect of cch1?/? and mid1?/? mutants on calcium fluctuation in response to alkaline stress.

2.3 CCH1和MID1基因缺失對PHO89-LacZ活性的影響分析

PHO89是一個堿性pH應答基因，且它的激活要通過鈣調神經磷酸酶途徑[11]。如果堿性 pH能引起胞內鈣濃度的瞬間升高，我們推測許多鈣離子或CaN應答的啟動子將會被激活，而在鈣離子濃度沒有發生變化的情況下，啟動子無應答。為證實這種假設，我們構建了PHO89-LacZ-His報告基因并將其分別轉化DAY1、cch1?/?和mid1?/?，利用β-半乳糖苷酶報告體系，通過比較不同pH以及不同鈣濃度條件下啟動子活性的強弱來分析CCH1和MID1基因缺失對PHO89-LacZ活性的影響。結果發現：1) 在pH 4條件下，PHO89啟動子幾乎無應答，只有較低的 LacZ活性，但是添加 Ca2+后，LacZ活性在野生型菌株中上升了10倍，在突變株中也上升了2~5倍。2) 在pH 8條件下，cch1?/?和mid1?/?中 LacZ活性比野生型菌株中的活性下降近 2倍(圖3)，說明堿性pH條件下缺失突變株對鈣離子濃度變化的影響直接影響到了PHO89啟動子的活性，而在pH8+EGTA條件下LacZ活性的明顯下降進一步說明PHO89-LacZ活性是鈣離子依賴性的。

2.4 Crz1p轉錄因子對鈣離子依賴性的 PHO89-LacZ活性的調控作用

Crz1p是鈣信號轉導途徑的核心，為了研究這種堿性pH誘導的鈣離子依賴性的PHO89-LacZ活性是否受到轉錄因子Crz1的調控作用，我們將含報告基因的質粒進一步轉化了crz1?/?菌株，并且在pH 4和pH 8兩種背景環境下，同時添加Ca2+和EGTA，以及CaN的免疫抑制劑FK506，通過測定12種條件下 LacZ的活性，比較野生型和突變型菌株中 β-半乳糖苷酶的活性差異，來分析 Crz1p轉錄因子對鈣離子依賴性的 PHO89-LacZ活性的調控作用。從圖4可以看出，1) 在crz1?/?菌株中，兩種pH條件時無論是否添加 Ca2+或藥物 FK506，都沒有明顯的 LacZ活性，證明PHO89啟動子的活性是受到 Crz1p正向調控的；2) 野生型菌株中，pH 4和pH 4+FK506這兩種條件下，只能檢測到較低的LacZ活性，補加Ca2+后，LacZ活性上升10倍，但由于FK506的添加，LacZ活性又下降了2倍；相比較酸性條件 (pH 4)，堿性條件下 (pH 8) 無論是否添加FK506都有較高LacZ活性，但在添加Ca2+螯合劑 EGTA后，LacZ活性明顯下降，而且 FK506的添加使得LacZ活性又下降了2倍。綜上可以得出，堿性pH壓力下鈣離子誘導的PHO89啟動子的激活是CaN/Crz1p依賴的。

圖3 含 PHO89-LacZ片段的野生型和缺失突變株在不同培養條件下的β-半乳糖苷酶活性分析Fig. 3 β-Galactosidase activity analysis of PHO89-LacZ band containing wild type and mutant strains.

圖4 Crz1p對堿性pH壓力下鈣離子誘導的PHO89啟動子的調控作用Fig. 4 Regulating role of Crz1p in activation of calciumresponsive PHO89 promoter under alkaline stress.

2.5 Crz1p轉錄因子對鈣通道基因CCH1和MID1的調控作用

對堿性pH的應答需要Rim101p、Crz1p和CaN，并且依賴于許多Na+-ATP酶轉運體基因的表達。例如，在白念珠菌中，ENA2受到Rim101的嚴格調控，但是 Crz1在堿性 pH應答中似乎需要更多的除Na+-ATP酶轉運體基因以外的靶點[10]。CCH1和MID1基因作為鈣離子內流的通道，是CaN激活必需的，而cch1?/?和mid1?/?在堿性pH條件下對鈣內流以及對 PHO89-LacZ活性的影響，很大程度是由于CaN沒有被激活。因此，我們推測為了應答堿性pH，Crz1p對CCH1和MID1基因也具有一定的調控作用。

通過熒光定量PCR，我們比較了pH 4和pH 8兩種條件下 CCH1和 MID1基因在野生型菌株和crz1?/?缺失菌株中的表達差異，從圖5中的結果可以看出，在 pH 8條件下，CCH1和 MID1基因在crz1?/?缺失菌株中的表達量都有顯著下降，是其在野生型菌株中的 40%~60%，添加藥物 FK506對CCH1和MID1基因的表達沒有明顯影響，證明堿性pH條件下CCH1和MID1基因的表達受到Crz1p轉錄因子的正向調控作用，但非 CaN依賴。而在pH 4條件下，CCH1和MID1基因在crz1?/?缺失菌株中的表達量與其在野生型菌株中沒有太大的差異，但是藥物 FK506的添加，使其表達量下降了將近50%，說明CaN對酸性pH條件誘導的CCH1和MID1基因的表達是必需的。

圖5 CCH1和MID1基因在野生型菌株和crz1?/?缺失菌株中的表達差異Fig. 5 Differential expression of Candida albicans MID1 and CCH1 in wild type and crz1?/? mutant strains.

3 討論

真核生物細胞能夠通過許多信號轉導機制來對各種各樣的環境壓力變化作出應答，鈣調神經磷酸酶CaN/Crz1途徑在pH變化過程中調控離子的動態平衡[17]。本文重點研究了以Cch1p/Mid1p通道為起點影響堿性 pH壓力條件下的鈣內流，以及 Crz1p為核心對相關基因進行調控的鈣離子信號轉導途徑在堿性pH壓力應答中的重要作用。實驗中首先需要解決的問題是尋找合適的方法測定堿性 pH條件對白念珠菌細胞胞內鈣波變化的影響，而報道較多的鈣發光蛋白法、Fura-2熒光指示劑負載法，或是使用單細胞鈣離子成像分析系統測定胞內鈣離子濃度變化的方法，都只能反映單個細胞在環境變化下胞內鈣波變化的情況，卻不能代表整體細胞的平均水平。本文結合 Fluo-3AM熒光染料負載與流式細胞術，對堿性pH壓力下胞內鈣波變化動力學的檢測，是微生物細胞胞內鈣離子測定方法的重要改進，實現了全細胞水平，使實驗結果更為科學、可信。

實驗中，我們發現堿性pH條件能引起胞內鈣離子濃度的瞬間變化并且這種變化在 cch1?/?和mid1?/?突變株中消失，Cch1p和Mid1p作為酵母細胞膜上高親和力的鈣離子轉運系統通道，能夠將胞外的鈣運送至胞內，CCH1和MID1基因的缺失必然會導致這種鈣內流受阻。我們的實驗結果顯示了CCH1和MID1基因在堿性pH誘導的胞內鈣離子濃度的瞬間升高過程中發揮著重要的作用，但這并不排除胞內鈣庫可能向細胞中釋放鈣離子，從而引起胞內鈣濃度升高的可能性，高的等滲壓力就能夠誘導液泡通過Yvc1p向胞內釋放鈣離子[18]。在釀酒酵母中，P-型ATP酶Pmr1p轉運體能夠將Ca2+和Mn2+運送回高爾基體，PMR1基因的缺失也可能會導致胞內鈣離子濃度的積累[19]。所以本實驗也使用同樣的方法分析了保存的 yvc1?/?和 pmr1?/?突變株在堿性pH條件下胞內的鈣波變化，結果發現突變菌株與野生型菌株中的鈣波變化基本一致，再次證明CCH1和MID1基因在鈣離子動態平衡和堿性pH條件下外鈣內流的調控過程中的重要作用。

Crz1p是酵母細胞鈣信號轉導過程中的核心轉錄因子，能夠特異性地與一個24 bp的CDRE序列結合，這對于鈣離子誘導的、CaN依賴的基因表達是必不可少的[20]。在堿性pH條件下，PHO89基因的表達上調，在其啟動子序列中很可能含有CDRE，我們的實驗證實了這一點，β-半乳糖苷酶體系的建立一方面說明了pPHO89-LacZ的表達是鈣離子依賴性的，另一方面在 crz1?/? 突變菌株中啟動子應答的消失以及在野生型菌株中添加FK506后LacZ活性的減弱，證明PHO89基因的表達是受到Crz1p嚴格調控的，并且是CaN依賴性的。既然Crz1p對堿性pH應答基因具有調控作用，鑒于其在鈣信號轉導途徑中的核心角色，而CCH1和MID1基因作為壓力變化時鈣離子信號傳遞的重要通道因子，我們推測Crz1p對CCH1和MID1基因也具有一定的調控作用，所以最后利用熒光定量PCR證實了這一點，但是Crz1p對CCH1和MID1基因的調控作用不是CaN依賴性的。

總之，白念珠菌對環境pH的應答與其致病性密切相關，對鈣信號途徑在堿性pH壓力應答中作用的研究將有助于我們進一步了解這種在醫學上極為重要的病原菌是如何在宿主中存活的，對臨床上念珠菌感染的治療和新藥物靶點導向具有重要的理論和實際意義。

致謝：本實驗中的部分菌株和質粒由美國明尼蘇達大學Dr. Dana Davis教授惠贈，在此表示衷心感謝！

[1] Kader MA, Lindberg S. Cytosolic calcium and pH signaling in plants under salinity stress. Plant Signal Behav, 2010, 5(3): 1559?2324.

[2] Bootman MD, Lipp P, Berridge MJ. The organization and functions of local Ca2+signals. J Cell Sci, 2001, 114(12): 2213?2222.

[3] Wiesenberger G, Steinleitner K, Malli R, et al. Mg2+deprivation elicits rapid Ca2+uptake and activates Ca2+/calcineurin signaling in Saccharomyces cerevisiae. Euk Cell, 2007, 6(4): 592?599.

[4] Gennemark P, Nordlander B, Hohmann S, et al. A simple mathematical model of adaptation to high osmolarity in yeast. In Silico Biol, 2006, 6: 193?214.

[5] Viladevall L, Serrano R, Ruiz A, et al. Characterization of the calcium-mediated response to alkaline stress in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem, 2004, 279(42): 43614?43624.

[6] Muller EM, Locke EG, Cunningham KW. Differential regulation of two Ca(2+) influx systems by pheromone signaling in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 2001, 159(4): 1527?1538.

[7] Muend S, Rao R. Fungicidal activity of amiodarone is tightly coupled to calcium influx. FEMS Yeast Res, 2008, 8(3): 425?431.

[8] Brand A, Shanks S, Duncan VMS, et al. Hyphal orientation of Candida albicans is regulated by a calcium dependent mechanism. Curr Biol, 2007, 17(4): 347?352.

[9] Kullas AL, Martin SJ, Davis D. Adaptation to environmental pH: integrating the Rim101 and calcineurin signal transduction pathways. Mol Microbiol, 2007, 66(4): 858?871.

[10] Serrano R, Ruiz A, Bernal D, et al. The transcriptional response to alkaline pH in Saccharomyces cerevisiae: evidence for calcium-mediated signalling. Mol Microbiol, 2002, 46(5): 1319?1333.

[11] Gupta SS, Ton VK, Beaudry V, et al. Antifungal activity of amiodarone is mediated by disruption of calcium homeostasis. J Biol Chem, 2003, 278(31): 28831?28839. [12] Wilson RB, Davis D, Mitchell AP, et al. Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions. J Bacteriol, 1999, 181(6): 1868?1874.

[13] Yong-Un B, Samuel JM, Dana AD. Evidence for novel pH-dependent regulation of Candida albicans Rim101, a direct transcriptional repressor of the cell wallβ-Glycosidase Phr2. Eukaryotic Cell, 2006, 5(9): 1550?1559.

[14] Gui L, Liang Y, Wei DS, et al. Regulating promoter element of iron-dependent gene FRP1 in Candida albicans by site-directed mutation. Chin J Biotech, 2008, 24(8): 1348?1353.桂磊, 梁勇, 魏東盛, 等. 利用定點突變分析白念珠菌依賴鐵基因 FRP1啟動子元件. 生物工程學報, 2008, 24(8): 1348?1353.

[15] Zhang YF, Jiao LX, He D, et al. Isolation method of total RNA from Candida Albicans. J Jilin Univ: Med Ed, 2007, 33(2): 359?3611.張云峰, 焦立新, 賀丹, 等. 白色念珠菌總RNA的提取方法. 吉林大學學報: 醫學版, 2007, 33(2): 359?3611.

[16] Schmittgen TD, Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nat Protoc, 2008, 3(6): 1101?1108.

[17] Bensen ES, Martin SJ, Li M, et al. Transcriptional profiling in Candida albicans reveals new adaptive responses to extracellular pH and functions for Rim101p. Mol Microbiol, 2004, 54(5): 1335?1351.

[18] Denis V, Cyert MS. Internal Ca2+release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue. J Cell Biol, 2002, 156(1): 29?34.

[19] Bates S, MacCallum D M, et al. Candida albicans Pmr1p, a secretory pathway P-type Ca2+/Mn2+-ATPase, is required for glycosylation and virulence. J Biol Chem, 2005, 280(24): 23408?23415.

[20] Stathopoulos AM, Cyert MS. Calcineurin acts through the CRZ1/TCN1-encoded transcription factor to regulate gene expression in yeast. Genes Dev, 1997, 11(24): 3432?3444.