甘蔗鋅指蛋白基因ShSAP1的克隆與表達模式

李曉君，蔡文偉，張樹珍，許莉萍，陳萍，王俊剛

1 中國熱帶農業科學院 熱帶生物技術研究所甘蔗研究中心，海口 571101

2 福建農林大學 農業部甘蔗遺傳改良重點開放實驗室，福州 350002

3 海南大學農學院，儋州 571737

在動物中，具有A20/AN1鋅指結構域的蛋白已被廣泛研究，該類蛋白作為免疫性炎癥和細胞凋亡的負調因子，在免疫應答中具有重要的調控作用[1-3]。植物中，具有 A20/AN1鋅指結構域的蛋白與逆境應答密切相關，研究者將其定義為 SAP (Stress associated protein) 家族[4-6]。研究發現，水稻所有SAP家族成員的表達能被干旱、高鹽和冷凍中的一種或多種脅迫誘導增強[6]。對番茄進行冷凍、熱激、鹽脅迫、干旱、機械傷害、ABA、氧脅迫和細胞膜傷害處理，利用real-time PCR分析其13個SAP家族成員在進行處理前后的表達模式發現，所有SAP成員都與一種或多種逆境應答相關[7]。

甘蔗Saccharum officinarum是一種重要的糖料作物，也是重要的能源作物。非生物脅迫，尤其是高鹽與干旱，是全球作物減產的主要原因[8]。2010年中國南方干旱造成云南、廣西、廣東、海南等地甘蔗大規模減產。研究甘蔗自身的抗逆基因功能，對研究甘蔗的抗逆機制及抗逆分子育種具有重要意義。本研究于甘蔗熱帶種Badila莖稈成熟與未成熟抑制差減文庫中篩選到一個具有完整閱讀框的EST，其推導蛋白具有A20/AN1鋅指結構域，通過Smart Race法獲得了基因全長，命名為 ShSAP1 (Saccharum stress-associated protein 1)。通過甘蔗基因組DNA擴增ShSAP1基因以確定基因內是否具有內含子，并通過Southern blotting分析了ShSAP1在Badila內的拷貝數，從而對ShSAP1基因結構進行分析；通過半定量 RT-PCR對 ShSAP1基因在甘蔗Badila不同部位、不同莖節及高鹽脅迫、模擬干旱、脫落酸 (ABA)、赤霉素 (GA3)、乙烯利 (ET) 處理下的mRNA表達量進行了分析，以期對ShSAP1在甘蔗成熟與逆境應答中的功能進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

甘蔗熱帶種拔地拉 (Badila)，為本實驗室基地種植。

1.2 主要試劑

RNA plant kit、DNA消化酶購自Biomega公司；反轉錄試劑盒購自Fermentas；Southern blotting試劑盒為Roche公司的DIG DNA Labeling and Detection KitⅠ；Taq DNA聚合酶、PMD18-Vector及限制性核酸內切酶購自TaKaRa公司；氨芐青霉素 (Amp)、瓊脂糖購自Sigma公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自Biomega公司；大腸桿菌DH5α感受態購自天根生物；ABA、ET、GA3購自上海生工；常用的化學試劑為國產分析純。本研究所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

1.3 表達分析材料及處理方法

甘蔗不同部位表達分析材料：Badila成熟植株。不同脅迫和激素處理組的表達分析材料：四葉期甘蔗無菌組培苗，MS培養基培養。24 h處理組：高鹽脅迫和模擬干旱處理，將幼苗接入中含有200 mmol/L NaCl，10% (W/V) PEG6000的MS培養基中；激素處理，分別用100 μmol/L ABA，200 mg/L GA3，1 mmol/L ET噴施幼苗葉片；CK不做任何處理，處理后將幼苗于人工培養箱中光照培養，16 h光照28 ℃/8 h黑暗24 ℃，24 h后提取葉片RNA。激素時間梯度處理組：選取大小一致的幼苗，用100 μmol/L ABA、200 mg/L GA3、1 mmol/L ET進行噴施處理，處理時間分別為3 h、6 h、12 h，處理開始于12 h處理組，同時對CK噴施同體積的無菌水，隔6 h進行第2批處理，隔9 h進行第3批處理，處理期間全程光照培養，12 h后同時提取葉片RNA。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4 核酸提取及反轉錄

RNA提取參照Biomega RNA Plant kit說明書，取5 μg RNA按照Fermentas反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，DNA提取依照CTAB法。

1.5 ShSAP1的克隆

由本實驗室莖稈成熟相關 cDNA文庫中獲得ShSAP1的EST序列 (716 bp)，具有完整的ORF，經同源序列的分析比對確定 5'端完整，以獲得的ShSAP1 5'端設計引物ShSAPP3，全長cDNA文庫噬菌體臂上的序列設計引物 PTR3，以本實驗室全長cDNA文庫庫液為模板擴增ShSAP1 3'端cDNA序列。 PCR反應條件為94 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s，59 ℃45 s，72 ℃ 1 min，4個循環；94 ℃ 30 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min ，8個循環；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，25個循環；72 ℃ 10 min 。

1.6 ShSAP1基因組全長的獲得及ShSAP1的拷貝數確定

于ShSAP1拼接序列5′末端和3′末端設計引物P1和P2，以Badila cDNA及DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應條件：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s，57 ℃1 min，72 ℃ 2 min，30個循環；72 ℃ 10 min。以ShSAP1 cDNA 全序列為模板，依照 DIG DNA Labeling and Detection Kit Ⅰ合成探針，DNA提取如前介紹，DNA酶切電泳和轉膜方法參照文獻[9]，雜交及顯色參照 Roche DIG DNA Labeling and Detection Kit Ⅰ試劑盒說明書進行。

1.7 半定量RT-PCR分析ShSAP1的表達模式

半定量RT-PCR反應中的內參基因GAPDH引物為GADPH1和GADPH2，ShSAP1的擴增引物：ZP1和ZP2。先用內參基因GADPH將模板調整至基本一致，選取平臺期之前的循環作為半定量RT-PCR的循環數，內參基因和目的基因的PCR反應條件均為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，X個循環；72 ℃ 10 min 。X表示循環數，不同部位和24 h處理組的為27個循環，12 h處理組中ABA小組為27個循環，ET和GA3小組為30個循環。每組PCR重復3次。

1.8 生物信息學分析

ShSAP1氨基酸序列經 NCBI PSI-BLAST (Position-specific iterated BLAST)，選擇有研究報道的相近序列進行同源性分析，使用 DNAMAN和MEGA4進行 A20/AN1結構域比較和系統發育樹構建。

2 結果與分析

2.1 甘蔗ShSAP1基因的的克隆

以本實驗室全長 cDNA文庫庫液為模板，用ShSAP-P3和 PTR3兩條引物采用降落 PCR擴增ShSAP1的3′端，得到900 bp左右的條帶，結果如圖1所示，經測序，該片段核苷酸序列長度為872 bp，含有25個PolyA尾，將3'端獲得序列與差減文庫中得到的5'端716 bp序列進行拼接，得到cDNA全長1 008 bp，命名為 ShSAP1，GenBank登錄號為：HM991960，ShSAP1基因起始密碼子 ATG位于127 bp處，終止密碼TAG位于642 bp處，閱讀框為516 bp，推導171個氨基酸，具有A20/AN1鋅指結構域。

圖1 Smart Race PCR擴增ShSAP1 3′序列Fig. 1 Amplification of the 3′ sequence of ShSAP1 gene by Smart Race PCR. M: DNA maker DL2000; 1: 3′ PCR products of ShSAP1.

2.2 ShSAP1與其他植物SAP家族基因的鋅指結構域比較與系統進化分析

SAP蛋白家族具有A20/AN1鋅指結構域特征，A20結構位于蛋白的N端，具有Cys2/Cys2鋅指結構，首次發現于人類血管內皮細胞中的一個 TNFα-誘導蛋白中[10]，Linnen等在爪蟾的受精卵動物半球母系來源RNA編碼蛋白中首次鑒定AN1鋅指結構域[11]，經典的 AN1結構模式為 CX(2)CX(9-12) CX(1-2)CX(4)CX(2)HX(5)HXC，X為任意氨基酸，后來的研究中把CX(4)CX(9-12)CX(1-2)CX(4)CX(2) HX(5)HXC也定義為AN1鋅指。AN1和A20結構都參與了免疫反應，AN1與A20鋅指常常相互連接[1,12]。OSiSAP1是植物中首次發現同時具有 AN1和A20鋅指結構域的蛋白，研究表明OSiSAP1與逆境應答相關，并能增強轉化煙草的抗逆性[13]，隨后水稻、擬南芥和番茄等植物的A20/AN1鋅指蛋白也被研究，結果發現A20/AN1鋅指蛋白與植物的逆境應答相關[6-7]。

ShSAP1編碼蛋白 N端具有一個 Cys2/Cys2鋅指，位于14~40個氨基酸之間，C端112~149氨基酸序列間具有AN1鋅指結構域，其鋅指序列模式為CX(2)CX(10)CX(1)CX(4)CX(2)HX(5)HXC，具有相同結構的蛋白往往行使相似的功能，為此，我們將甘蔗的ShSAP1同目前研究較清楚的其他植物SAP家族基因進行了氨基酸序列比較及同源進化樹分析，結果見圖2。ShSAP1具有SAP家族基因的保守鋅指結構，與甘蔗的Sc-zf和水稻的OSiSAP8親緣關系最近。ShSAP1推導氨基酸序列與劉金仙等[14]于福農22中分離得到的甘蔗鋅指蛋白基因Sc-zf氨基酸序列基本一致，而兩端非編碼區核酸序列卻有明顯差異，經 DNAMAN分析ShSAP1與Sc-zf的cDNA序列相似性為81.57%，推測ShSAP1與Sc-zf為同源基因。

2.3 ShSAP1基因結構

以引物P1、P2從Badila cDNA與基因組DNA中擴增ShSAP1，以驗證拼接結果的正確性，并分析ShSAP1的基因結構。由cDNA擴增得到1 000 bp左右的片段 (圖3A)，而從基因組DNA中可以擴增得到2 300 bp左右的片段 (圖3B)，片段測序結果經分析后發現由 cDNA擴增得到的序列與之前的拼接結果吻合，由基因組DNA擴增片段的大小為2 241 bp，為ShSAP1的基因組序列，經GSDS網站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) 分析發現 ShSAP1有兩段大小分別為 202 bp和 1 052 bp的內含子位于5'UTR區，而其閱讀框則是連續的 (圖3C)。為了確定ShSAP1的拷貝數，我們以ShSAP1的cDNA序列合成探針對 Badila基因組進行了 Southern blotting分析，結果如圖3D所示，ShSAP1的拷貝數為1~2個，為低拷貝基因。

2.4 ShSAP1的表達分析

圖2 ShSAP1推導蛋白與其他A20/AN1型鋅指蛋白的氨基酸序列比較及系統發育樹分析Fig. 2 Comparison of ShSAP1 A20 and AN1 zinc finger domain with other zinc-finger protein and phylogenetic tree analysis. Conserved cysteine and histidine are indicated in box. (A) Putative functional domains of ShSAP1. (B) N-terminal A20 type zinc-finger. (C) C-terminal AN1-type zinc-finger. (D) phylogenetic tree of the related zinc finger proteins. proteins used in this analysis have been studied and have A20 and AN1 zinc finger domains. Protein accession number are showed in the bracket.

圖3 ShSAP1的基因結構 (A、B、C) 與甘蔗基因組Southern blotting分析Fig. 3 Gene structure (A, B, C) and genome Southern blotting (D) of ShSAP1. (A) M: DL5000 DNA marker; 1: PCR product of ShSAP1 from cDNA. (B) M: DL5000 DNA maker; 2: PCR product of ShSAP1 from genomic DNA. (C) Two introns (indicated by line ) located in the 5′ UTR region of ShSAP1 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/). (D) Results of genome Southern blotting. Total genomic DNA was digested by Hind III (H), Xba I (X), BamH I (B).

劉金仙等對甘蔗Funong 22中克隆得到的Sc-zf進行了表達分析，發現 Sc-zf在黑穗病菌 Ustilago scitaminea、水楊酸 (SA)、H2O2、NaCl和 PEG 脅迫下表達特性不同，受到黑穗病菌和NaCl的誘導，PEG的抑制，但也受SA和H2O2的影響[14]，這與前人所做的SAP家族基因在逆境下的表達特性存在差異。ShSAP1由甘蔗Badila成熟與未成熟莖稈抑制差減文庫中篩選而出，為了分析ShSAP1與Badila成熟的關系，我們選取Badila成熟植株不同部位和不同莖節進行了表達分析，結果如圖4-A所示，ShSAP1在Badila葉片、莖及根部均有表達，隨著莖稈成熟度增加，ShSAP1的表達量也隨之升高。甘蔗3~4節為快速生長部位，同時有少量蔗糖的積累，7~8節為正在成熟的莖節，13~14節為成熟莖節，糖分趨于飽和，21~22莖節的糖分已經飽和[15]，甘蔗在成熟過程中，糖分不斷累積，滲透物質不斷增加，抗逆性不斷增強，我們推測ShSAP1基因與甘蔗的成熟和糖分累積存在一定的關系。

在無菌條件下對Badila組培苗進行不同激素、干旱及鹽脅迫下ShSAP1的表達分析發現，Badila幼苗ShSAP1的表達能被ABA、ET、GA3、模擬干旱及鹽脅迫誘導增強 (圖 4B)。在 ABA、ET和 GA3處理下，ShSAP1的表達水平隨著處理時間延長持續增加，12 h內基本達到較高水平 (圖4C)。ET和GA3是植物成熟和莖節伸長的2種重要激素，ShSAP1可能與甘蔗成熟與莖節生長有關。根據ShSAP1在模擬干旱、鹽脅迫及ABA處理下的表達模式，我們推測ShSAP1可能參與了甘蔗依賴于ABA的早期逆境應答過程。

圖4 ShSAP1的表達模式分析Fig. 4 Expression analysis of ShSAP1. GADPH was used as internal control. (A) The expression level of different part and stalks in sugarcane. (B) Expression of ShSAP1 in sugarcane seedlings under salt (200 mmol/L), drought (10% PEG6000), GA3 (200 mg/L), ABA (100 μmol/L) and ET (1 mmol/L) after 24 h treatment. (C) Changes of ShSAP1 expression level in sugarcane seedlings under ABA (100 μmol/L), ET (1 mmol/L) and GA3 (200 mg/L) treatment within 12 h.

3 討論

A20/AN1鋅指蛋白因在動物免疫應答中具有重要作用而被廣泛研究，轉錄因子 NF-κB (Nuclear factor kappa enhancer binding protein) 在細胞凋亡、免疫和炎癥反應中起著相當作用[16]。A20鋅指N端具有去泛素化酶活性，C端具有泛素連接酶活性，IκB是核因子NF-κB的抑制子。A20鋅指一方面通過泛素連接酶與IκB激酶IKK作用使其降解，阻止IκB磷酸化；另一方面通過去泛素化IκB-26S蛋白酶復合體，阻止IκB降解，從而抑制NF-κB的活性，降低過敏性反應及細胞凋亡[2,10-12,17]。植物中的 SAP家族，目前研究較為深入的有水稻的 OsiSAP1、ZFP177、OsiSAP8、擬南芥的 AtSAP12、獐毛的AlSAP[13,18-21]，上述水稻的 SAP基因均參與了水稻逆境應答，應答模式有所差異，SAP1和SAP8與干旱和鹽脅迫密切相關，在煙草和水稻中過表達OsiSAP1和 OsiSAP8能顯著提高轉化植株的抗鹽抗旱性，OsiSAP8定位于細胞質，酵母雙雜交表明OsiSAP8的 A20與自身和 AN1具有相互作用[18]；ZFP177則在高溫和凍害應答中起作用，亞細胞定位于細胞質，過表達ZFP177能提高轉基因煙草的抗凍抗高溫能力[19]。研究者推測水稻SAP家族可能通過泛素蛋白酶途徑降低逆境對植物造成傷害，如通過降解細胞凋亡中的關鍵因子來增強植物抗逆性[18]。AtSAP12具有2個AN1結構域，在凍害和鹽脅迫下表達增強，其蛋白構象能被氧化還原劑改變，研究者推測SAP12是一個氧化還原劑感應器，通過構象變化與蛋白結合，作為激活子或抑制子來調控信號傳遞[20]。鹽土植物獐毛AlSAP的表達水平能被高鹽、干旱、冷凍、高溫及ABA和SA誘導增強，過表達AlSAP可提高煙草的抗旱和抗鹽能力，轉化植株的 ROS清除系統和滲透保護的基因表達也相對增強[21]。A20/AN1鋅指蛋白可能屬于植物逆境信號通路中的上游調控因子，通過抑制或激活信號傳遞相關蛋白進而調控下游基因表達，SAP家族基因在植物抗逆基因過程中具有很好的應用前景，但其作用的分析機制仍然需要進一步研究。

甘蔗在成熟過程中，伴隨著糖分等滲透物質的不斷累積，抗逆性不斷增強，ShSAP1可能參與了甘蔗成熟相關如可溶性糖累積等過程。根據 ShSAP1在ET、GA3、ABA、干旱和鹽脅迫的表達分析結果，我們推測 ShSAP1可能參與了 ET、GA3的信號轉導，在干旱和鹽脅迫下參與了早期依賴于ABA的信號轉導從而調控下游基因的表達。ShSAP1在甘蔗成熟與逆境應答中的功能及其調控機制仍需要進一步的研究，包括下游調控基因網絡及轉基因分析等。本文對ShSAP1的基因結構及表達模式進行了分析，為ShSAP1的功能研究打下了基礎。

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