不依賴油水界面激活的黑曲霉脂肪酶突變體的構建

陳的，舒正玉，薛龍吟，林瑞鳳，吳繼光，蔣詠梅，李欣，林躍鑫,2，黃建忠

1 福建師范大學工業微生物教育部工程研究中心 福建省現代發酵技術工程研究中心 福建師范大學生命科學學院，福州 350108

2 寧德師范學院，寧德 352100

脂肪酶 (Lipase，EC3.1.1.3) 又稱為甘油三酰酯水解酶，能有效地催化三酰基甘油酯水解為甘油和游離的脂肪酸。脂肪酶活性中心的催化部位通常是由天冬氨酸或谷氨酸、絲氨酸和組氨酸組成的催化三聯體[1]。通常情況下，大多數脂肪酶的活性中心都被一種稱為“蓋子”的結構所覆蓋，阻止了底物與活性中心的直接結合。蓋子結構具有多樣性，有的僅由1個單一的α-螺旋構成，有的由2個α-螺旋構成，還有的僅由1個Loop環構成，少數脂肪酶無蓋子結構[2-3]。在油-水界面，脂肪酶蓋子結構域構象發生改變，暴露出脂肪酶的活性中心，底物進入活性中心，脂肪酶的催化活性被激活。脂肪酶的催化活性在油水界面大幅度提高的現象稱為界面激活[4-5]。受界面激活催化特性的影響，底物的團聚狀態一定程度上影響脂肪酶的催化效率。為了獲得不依賴界面激活的脂肪酶突變體，科研人員設計和構建了一系列“無蓋型”或“開蓋型”脂肪酶突變體。

根據已解析的枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis脂肪酶A和南極假絲酵母Candida antarctica脂肪酶B的 3D結構，結合其催化特性[6-7]，可以推測：具有“蓋子”結構域和界面激活特性并不是鑒別脂肪酶和酯酶的恰當標準[8]，脂肪酶在沒有蓋子結構域的情況下依然可以表現出催化活性。Miled等利用基因工程手段缺失人胃脂肪酶 (Human pancreatic lipase，HPL) 的“蓋子”結構域后獲得的脂肪酶突變體，其催化活性較野生型人胃脂肪酶顯著降低[9]。此外，蓋子結構域還與脂肪酶的其他酶學性質相關，如對映體選擇性、鏈長特異性和熱穩定性等[10-12]。

正因為脂肪酶蓋子結構域對于維持其正常功能非常重要，因此利用基因工程手段構建“開蓋型”脂肪酶突變體是十分必要的。Carrièr等利用人胃脂肪酶的蓋子結構域置換豬胰脂肪酶 (Guinea pig pancreatic lipase related protein 2，GPLRP2) 對應結構域后獲得的豬胰脂肪酶突變體，其蓋子結構具有永久開蓋型構型，同時該突變體不再依賴油水界面激活[13]。這一結果表明，脂肪酶具有的界面激活特性不僅與蓋子結構域的存在有關，其他結構因子(如：蓋子結構兩側鉸鏈區的氨基酸殘基等) 對于穩定蓋子構型的開或關有著重要的作用。Brzozowski等報道疏棉狀嗜熱絲孢菌Thermomyces lanuginosa脂肪酶中位于蓋子結構域第一個鉸鏈區的 Arg84對于觸發脂肪酶界面活性具有重要的作用[14]。類似的實驗結果在米黑根毛霉Rhizomucor miehei脂肪酶中也得到了證實：位于該脂肪酶蓋子結構域第一個鉸鏈區的Ser84對觸發該脂肪酶界面活性也具有重要的作用[15]。

微生物脂肪酶和酯酶均屬于 α/β水解酶折疊家族，均能催化酯鍵的斷裂，二者的三級結構具有高度的相似性，但僅脂肪酶表現出界面激活的催化特性。在先前的工作中，我們對比了黑曲霉脂肪酶(Aspergillus niger lipase，ANL) 和黑曲霉阿魏酸酯酶一級結構和3D結構的異同。在一級結構上，二者的氨基酸殘基序列相似性達36%；在3D結構上，二者的蓋子結構域存在顯著差異。在活性中心的上方，黑曲霉脂肪酶和黑曲霉阿魏酸酯酶均可形成一段α-螺旋，但黑曲霉阿魏酸酯酶該α-螺旋的位置較黑曲霉脂肪酶對應結構的位置而言，更遠離活性中心。我們預測這一結構差異可能與二者的催化特性差異之間存在一定的關聯性。進一步分析該 α-螺旋兩側鉸鏈區的氨基酸殘基序列，我們預測位于ANL蓋子結構域第一鉸鏈區的 Ser84和第二鉸鏈區的Asp99對于蓋子結構域的開或閉構型可能發揮了決定性的作用[16]。本實驗分別用黑曲霉阿魏酸酯酶多肽鏈中與黑曲霉脂肪酶的Ser84和Asp99相對應的氨基酸殘基置換Ser84和Asp99，構建2個黑曲霉脂肪酶突變體：ANL-Ser84Gly和ANL-Asp99Pro，并測定了這2個突變體的部分酶學性質。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 菌株和質粒

克隆宿主 Escherichia coli DH5α，表達宿主Pichia pastoris GS115及質粒pPIC9K-lipanl均為本實驗室保存 (lipanl為黑曲霉脂肪酶成熟肽的編碼基因序列)[16]。

1.1.2 酶和試劑

高保真Pfu DNA聚合酶購自Sangon生工生物工程 (上海) 有限公司；各種限制性內切酶和 T4 DNA連接酶均購自 TaKaRa寶生物工程 (大連) 有限公司；系列4-硝基苯羧酸酯均購自Sigma公司；甲醇和甘油酯為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉脂肪酶基因引入突變位點

通過重疊延伸聚合酶鏈式反應對黑曲霉脂肪酶基因進行定點突變，引入突變位點。基于畢赤酵母密碼子偏愛性設計的用于 DNA定點突變的引物見表1。重疊延伸聚合酶鏈式反應中使用的PCR引物、模板、PCR擴增條件及產物大小見表2。用EcoRⅠ和 NotⅠ酶切 PCR擴增獲得的引入突變位點后的lipanl全長基因，然后將其連接到經同樣酶切后的pPIC9K上。重組 pPIC9K-lipanl-S84G和 pPIC9K-lipanl-D99P轉化E. coli DH5α，DNA測序檢驗引入突變位點的正確性。

表1 本實驗中使用的PCR系列引物Table 1 PCR primers used in this study

表2 重疊延伸PCR反應中使用的引物、模板、PCR擴增條件及產物大小Table 2 Primer pairs, templates and PCR programs used for lipanl mutagenesis and the resulting PCR products

1.2.2 P. pastoris GS115的轉化、脂肪酶基因的誘導表達和脂肪酶的純化

P. pastoris GS115的轉化、脂肪酶基因的誘導表達和脂肪酶的純化均參照文獻[16]。重組脂肪酶經Endoglucosidase H處理、Sephadex G-75凝膠柱純化及凍干。重組黑曲霉脂肪酶蛋白質濃度的測定參照Bradford法[17]。

1.2.3 脂肪酶活性的測定

脂肪酶活性的平板定性檢測方法參照Hiol等的平板檢測方法[18]，本實驗以三丁酸甘油酯作為脂肪酶活性的定性檢測底物。

脂肪酶活性的分光光度計檢測法參照Kordel等的檢測方法[19]，使用的緩沖液為0.05 mol/L His-HCl (pH 6.5)，45 ℃進行測定。在該反應條件下，每1 min從對應4-硝基苯羧酸酯上釋放出1 μmol對硝基苯酚作為1個脂肪酶活力單位 (U)。

為檢測黑曲霉脂肪酶及其突變體界面激活效應，參照 Martinelle等所報道的方法[20]，測定黑曲霉脂肪酶及其突變體水解不同濃度的 4-硝基苯丁酸酯的催化活力曲線。水解溫度為25 ℃，使用的緩沖液為0.05 mol/L His-HCl (pH 6.5)。

1.2.4 溫度對黑曲霉脂肪酶及其突變體穩定性的影響

55 ℃下溫育黑曲霉脂肪酶及其突變體，在0~60 min的不同時間間隔內，分別檢測殘余脂肪酶酶活。將初始脂肪酶酶活定義為100%。

2 結果

2.1 脂肪酶編碼基因的定點突變

微生物脂肪酶和酯酶具有相似的 α/β水解酶折疊結構，活性中心的催化位點均由 Ser-His-Asp/Glu三聯體構成[21]。盡管脂肪酶和酯酶均能催化三酰甘油酯水解為脂肪酸和甘油，或是此反應的逆向合成，但只有脂肪酶具有獨特的界面激活特性，而酯酶不具有此特性。在先前的研究中，我們對比了黑曲霉脂肪酶和黑曲霉阿魏酸酯酶的3D結構，并且預測黑曲霉脂肪酶蓋子結構域兩側的鉸鏈區影響脂肪酶蓋子的構型。進一步分析黑曲霉脂肪酶蓋子結構域兩側的氨基酸殘基序列和黑曲霉阿魏酸酯酶對應的氨基酸殘基序列，篩選出黑曲霉脂肪酶蓋子結構域兩側的2個氨基酸殘基：Ser84和Asp99，對脂肪酶蓋子的構型可能具有決定性的作用[16]。為了驗證該預測，將黑曲霉脂肪酶中的Ser84和Asp99分別用黑曲霉阿魏酸酯酶中對應的Gly和Pro殘基置換，構建黑曲霉脂肪酶突變體ANL-S84G和ANL-D99P。

利用表1中的引物對表2中的PCR反應體系及反應條件進行PCR擴增。PCR擴增產物經限制性內切酶酶切后插入表達質粒 pPIC9K。重組質粒pPIC9K-lipanl-S84G和 pPIC9K-lipanl-D99P經測序驗證閱讀框的正確性及突變位點氨基酸殘基的正確引入。突變氨基酸殘基引入位點對應的堿基序列見圖 1，測序結果表明在突變位點已成功引入置換的氨基酸殘基。

2.2 黑曲霉脂肪酶及其突變體的誘導表達及純化

將 pPIC9K-lipanl、 pPIC9K-lipanl-S84G 和pPIC9K-lipanl-D99P三個基因，分別導入到P. Pastoris GS115表達菌株中進行誘導表達，獲得的重組脂肪酶具有相同的相對分子量，大約為35 kDa (圖2A)。將20 μL重組脂肪酶用三丁酸甘油酯平板定性檢測，在ANL、ANL-S84G和ANL-D99點樣區周圍，形成了清晰的水解圈 (圖2B)。

2.3 黑曲霉脂肪酶及其突變體的底物特異性及熱穩定性檢測

圖1 lipanl, lipanl-S84G和lipanl-D99P的序列比對Fig. 1 Sequence alignment of lipanl, lipanl-S84G and lipanl-D99P.

圖2 黑曲霉脂肪酶及其突變體的純化和平板定性檢測Fig. 2 Purification and qualitative activity detection of A. niger lipase and A. niger lipase mutants. (A) SDS-PAGE analysis of the purified A. niger lipase and A. niger lipase mutants, M: protein markers. (B) Qualitative activity detection of A. niger lipase and A. niger lipase mutants on tributyrin-agar plate.

表3 黑曲霉脂肪酶及其突變體對系列4-硝基苯羧酸酯的水解活性Table 3 Specific activity of A. niger lipase and A. niger lipase mutants towards series of p-nitrophenyl esters

ANL-S84G 和ANL-D99P表現出了和ANL明顯不同的底物特異性和熱穩定性。水解系列 4-硝基苯羧酸酯實驗結果表明：較ANL而言，ANL-S84G的比活力顯著降低，降低幅度從29.8%到76.5%不等；而ANL-D99P水解4-硝基苯棕櫚酸酯的比活力上升了2.2倍 (表3)。ANL-S84G的比活力顯著降低可能是由于該突變導致重組脂肪酶 ANL-S84G形成了相對穩定的閉蓋構型。Brzozowski等認為T. lanuginosa脂肪酶在閉蓋構型狀態下，Arg84與 Asp57可形成氫鍵。在油水界面，Arg84與結構重排后的 Cys268之間形成新的氫鍵，這一變化誘發了脂肪酶蓋子結構的開啟，并激活了脂肪酶的活性[14]。根據該假說可以推測，黑曲霉脂肪酶的 Ser84與T. lanuginosa脂肪酶上的Arg84在脂肪酶分子中所處的位置相同，因此，在誘導脂肪酶構型轉變過程中，發揮了類似的功能。黑曲霉脂肪酶上的Ser84被Gly置換后，這一過程破壞了氫鍵的形成并將導致ANL-S84G突變體形成相對穩定的閉蓋構型，在油水界面，ANL-S84G能形成有效激活構型分子的比率將降低，ANL-S84G的比活力也因此降低。較ANL而言，ANL-D99P催化4-硝基苯棕櫚酸酯的比活力提高了2.2倍，而對4-硝基苯月桂酸酯和4-硝基苯肉豆蔻酸酯的比活力基本保持不變 (表 3)。黑曲霉脂肪酶上位于蓋子結構域第二鉸鏈區的Asp99被Pro置換后形成的脂肪酶突變體，擴大了蓋子結構的伸展空間，使其活性中心能容納更大的底物分子，因此，對長鏈脂肪酸酯的比活力有所提高。

上述分析，理論上解釋了 S84G 和D99P的突變，增加了ANL-S84G與ANL-D99P蓋子結構域及其兩側鉸鏈區的柔韌性，導致其催化活性的降低或提高。此外，S84G和D99P的突變，可能會破壞突變體ANL-S84G與ANL-D99P的二級結構作用力，使突變體分子的二級結構域更趨不穩定，從而導致了其熱穩定性的顯著降低 (圖3)。55 ℃下溫育15 min，ANL-S84G和 ANL-D99P分別失去了 85.1%和94.0%的初始酶性，而 ANL在相同情況下僅失去15.6%的初始酶活。S84G和D99P的突變，對脂肪酶活性和熱穩定性影響的分子機制還有待進一步深入研究。

圖3 黑曲霉脂肪酶及其突變體的熱穩定性檢測Fig. 3 Effect of temperature on the stability of A. niger lipase and A. niger lipase mutants.

2.4 4-苯硝基丁酸酯濃度對于黑曲霉脂肪酶和黑曲霉脂肪酶突變體的影響

4-硝基苯丁酸酯 (p-nitrophenyl butyrate，pNPB)在水溶液中是部分可溶的，因此常用其作為研究脂肪酶界面激活的底物。為了將 pNPB的自身水解控制在最小程度內，本實驗中使用的緩沖溶液為His-HCl (pH 6.5)。實驗結果表明，ANL和ANL-S84G表現出了明顯的界面激活效應 (圖 4A和 4B)，而ANL-D99P沒有表現出界面激活效應 (圖4C)。盡管ANL-S84G表現出界面激活效應，但其水解的動力學曲線和ANL相比，存在明顯不同。正如上文所提到的，按照Brzozowski假說，ANL-S84G突變體的蓋子結構應該保持相對穩定的“閉蓋”構型，但實驗結果依然具有界面激活特性。因此，除了 Arg84機制，ANL-S84G應該還存在其他機制觸發蓋子結構的開蓋。D99P位點的突變可能改變了ANL-D99P蓋子結構域第二鉸鏈區的β折疊的相對位置，從而產生了不依賴于油水界面激活的催化特性。

圖4 pNPB濃度對黑曲霉脂肪酶及其突變體水解活性的影響. (A) ANL. (B) ANL-S84G. (C) ANL-D99PFig. 4 Influence of pNPB concentration on the specific hydrolytic activity of A. niger lipase and A. niger lipase mutants. The arrow indicates the solubility limit of pNPB. (A) ANL. (B) ANL-S84G. (C) ANL-D99P.

3 討論

為了獲得不依賴界面激活的脂肪酶突變體，先前開展了大量探索性工作，基本都集中在對組成蓋子結構本身的氨基酸殘基進行突變。Miled等通過缺失蓋子結構域的方法獲得的人胃脂肪酶突變體，其催化動力學雖然較天然脂肪酶分子表現出明顯的差異，但并沒有獲得預期的開蓋型突變體分子[9]。Carrièr等則通過脂肪酶分子之間相互置換蓋子結構域，獲得永久開蓋的豬胰脂肪酶突變體[13]。本實驗則通過蛋白質大分子結構與功能之間的對應關系，建立起脂肪酶與酯酶催化特性的差異性與對應結構的差異性之間的聯系，結合生物信息學分析結果，對黑曲霉脂肪酶蓋子結構兩側鉸鏈區的氨基酸殘基進行突變，獲得了一個不依賴油水界面激活的黑曲霉脂肪酶突變體 (ANL-D99P)。ANL-S84G雖然依然保持界面激活的催化特性，但其催化動力學曲線與野生型ANL已發生顯著性改變。本實驗結果說明，脂肪酶的界面激活除了與脂肪酶的蓋子結構本身有關外，蓋子結構域之外的其他結構成分 (如蓋子結構兩側鉸鏈區的氨基酸殘基) 也參與了油水界面脂肪酶構型的改變。進一步對脂肪酶蓋子結構域更多的氨基酸殘基進行定點突變和疊加突變，篩選更多的脂肪酶突變體，有可能獲得性能更優良的脂肪酶突變體。同時，不依賴油水界面激活的脂肪酶突變體的構建，有利于進一步深入闡明脂肪酶界面激活的分子機制。

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