血凝抑制試驗(yàn)檢測犬血清中乙腦抗體

賈杏林,黎攝兒,謝軍芳,牛俊超 ,李曉云

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖南長沙410128)

乙型腦炎 (JE)是一種人畜共患傳染病,引起人的神經(jīng)系統(tǒng)疾病和豬的繁殖障礙性疾病[1]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,近年來寵物作為伴侶動(dòng)物日益成為人們生活的一部分。小動(dòng)物臨床診療中發(fā)現(xiàn)一些神經(jīng)癥狀患犬經(jīng)犬瘟熱檢查結(jié)果為陰性,以及一些公犬睪丸腫大,具有乙腦的癥狀,因而寵物是否攜帶乙腦病毒、是否發(fā)生乙腦疾病成為一個(gè)需要研究的課題,但目前該方面研究報(bào)道較少。為此,本研究采用傳統(tǒng)的血凝抑制試驗(yàn)檢測了34份犬的血清抗體,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試劑為某寵物醫(yī)院就診的寵物犬血清34份;乙腦血凝抑制試驗(yàn)診斷試劑購自云南流行病學(xué)防治研究所;乙腦陽性血清采用乙腦弱毒疫苗免疫犬3次制備 (HI效價(jià)為1∶40);乙腦陰性血清采自臨床健康犬 (HI結(jié)果為陰性);生理鹽水、p H7.4PBS,pH 9.0硼酸鹽緩沖液、p H6.4磷酸鹽緩沖液、12.5%高嶺土懸液采用常規(guī)配制;40%的鴿紅細(xì)胞懸液和0.5%鴿紅細(xì)胞懸液用p H 6.4磷酸鹽緩沖液配制。

1.2 試驗(yàn)方法

(1)血凝試驗(yàn) 首先用pH 9.0硼酸鹽緩沖液2 mL充分溶解乙腦血凝素抗原,混勻,4℃過夜,3 000 r/min離心20 min,取上清液作為血凝素抗原;加入pH 9.0硼酸鹽緩沖液于清潔干燥96孔V型微量板中,每孔25μL。再加入25μL乙腦血凝素于第一孔中,倍比稀釋,使血凝素充分混勻,最后1孔混勻后棄掉25μL。最后每孔中加入25μL 0.5%的鵝紅細(xì)胞溶液,充分混合,室溫1 h后判斷結(jié)果。

結(jié)果判定:++++為一層粉紅色的紅細(xì)胞均勻分散于孔底;+++基本同上,但邊緣不整齊有下垂趨勢;++為紅細(xì)胞于孔底形成環(huán)狀,環(huán)中央內(nèi)徑3 mm以上;+為紅細(xì)胞于孔底形成一個(gè)圈,但邊緣不光滑,四周有小凝集塊;-為紅細(xì)胞于孔底形成圓點(diǎn)。以50%紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集 (++)時(shí),血凝素的最高稀釋度為4個(gè)單位的血凝素單位。

(2)血清處理 首先取0.1 mL血清加12.5%高嶺土溶液0.9 mL,混合后放室溫中20 min,然后2 500 r/min離心15 min,加入40%鴿紅血細(xì)胞懸液 (用p H6.4磷酸鹽緩沖液配制)0.1 mL,振蕩混勻,在37℃吸附1 h,然后1 500 r/min離心10 min,直至其不凝集0.5%鴿紅細(xì)胞,上清液即為HI試驗(yàn)血清 (1∶10)。

(3)血凝抑制試驗(yàn) 乙腦血凝抑制試驗(yàn)按文獻(xiàn) [2]的方法進(jìn)行:用12.5%高嶺土溶液及40%鴿紅細(xì)胞溶液吸附待檢血清,直至完全不凝集0.5%鴿紅細(xì)胞,HI試驗(yàn)采用4個(gè)單位的血凝素。加入pH 9.0硼酸鹽緩沖液于清潔干燥96孔V型微量板中,每孔25μL。再加入1∶10血清25μL于清潔干燥96孔V型微量板中于第一孔,倍比稀釋,充分混勻,最后一孔棄掉25μL。再于每孔中加入25μL血凝素,充分混勻,加蓋置室溫1 h。最后于每孔中加入0.5%的鴿紅細(xì)胞懸液50μL,充分混合,室溫1 h后判斷結(jié)果。結(jié)果判定:HI效價(jià)大于1∶20判為陽性。實(shí)驗(yàn)孔全部呈現(xiàn)+++和++++的紅細(xì)胞凝集為陰性結(jié)果,陽性結(jié)果以++凝集孔作為該份血清的終點(diǎn)抑制效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

從表1可知,34份被檢血清中,陽性血清21份,占總數(shù)61.8%;20份血清血凝抑制效價(jià)在1∶20～1∶80之間,占陽性血清的95.2%。

表1 34份犬血清中乙腦抗體檢測結(jié)果

3 討論

犬是人類伴侶動(dòng)物,隨著我國城市化進(jìn)程加快和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,其數(shù)量不斷增加,與人類關(guān)系愈來愈密切,其是否感染乙腦是一個(gè)值得研究的課題,目前尚未見到研究報(bào)道。本研究在犬血清中檢出了流行性乙型腦炎抗體,且陽性率較高,提示存在犬感染乙腦病毒的可能性,因此,有必要作進(jìn)一步研究和探索。

乙腦是以腦實(shí)質(zhì)炎癥、神經(jīng)原變性、壞死為主要病理特征的中樞神系統(tǒng)疾病,從大腦到脊髓都可被侵犯[3]。在檢測的臨床樣本中,8只病犬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,但犬瘟檢測為陰性,乙腦檢測為陽性,經(jīng)問診犬只未進(jìn)行過乙腦疫苗注射,因而可能為乙腦病毒侵害了犬的神經(jīng)系統(tǒng)而引起了神經(jīng)癥狀。

乙腦血凝抑制試驗(yàn)可以很好地用來檢測乙腦炎病毒野毒感染產(chǎn)生的血凝素抗體效價(jià),具有簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn),因而本試驗(yàn)采用了該方法。但犬血清非特異性凝集較多,在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用30%鴿紅細(xì)胞懸液處理犬血清后仍有一部分犬血清中非特異性凝集未消除,便將濃度提高到40%[3],消除了大部分被檢犬血清與0.5%的鴿紅細(xì)胞懸液的凝集情況,還有一些犬血清非特異性凝集仍未消除,采用鴿紅細(xì)胞泥進(jìn)行吸附,這樣既沒有改變待檢血清的體積,又消除了血清中非特異性凝集。

[1]殷 震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué) (第2版)[M].北京:科學(xué)出版社,1997.633～641.

[2]自登云,陳伯權(quán),俞永新.蟲媒病毒與蟲媒病毒病 [M].昆明:云南科技出版社,1994.151～155.

[3]Jia Xinglin,Chen Huanchun,Wang Xiang,etal.Quantitativeand qualitative study of Enzyme-linked Immunosorbent Assay to detect IgG against Japanese Encep halitis Virus in swine sera[J].Veterinary Research Communications,2005,29:159～169.