肺癌循環腫瘤細胞臨床應用的研究進展

平偉 付向寧

肺癌的發病率和死亡率在惡性腫瘤中居首位，腫瘤復發或遠處轉移是導致患者死亡的主要原因。循環腫瘤細胞（circulating tumor cell, CTC）在肺癌的血行轉移中具有極其重要的作用。臨床研究[1-5]顯示CTC與肺癌臨床分期有關，在肺癌的早期診斷、療效監測和預后評估及個體化治療中具有重要的臨床意義。

1 肺癌CTC概述

肺癌是一種全身性疾病，其發病率正逐年上升，全球每年死于肺癌的人數大約有110萬。很多患者確診時已為晚期，錯過最佳手術時期，此外無法耐受放療或化療及化療后耐藥等原因導致肺癌5年生存率不到15%。I期經手術根治性治療的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）仍有超過30%患者在5年內復發[6]，且復發部位多為全身性轉移，提示現有臨床分期的早期就可能已有肺癌微轉移的發生[7]。血行播散是肺癌轉移的重要途徑，腫瘤細胞可以通過血液循環發生遠處轉移。腫瘤細胞進入血液循環是腫瘤發生遠處轉移的關鍵步驟之一，因此對肺癌CTC的檢測研究受到越來越多的重視。

CTC目前定義為自發或因診療操作由實體瘤或轉移灶釋放進入外周血循環的腫瘤細胞[8]。源于肺癌實體瘤的腫瘤細胞不斷增殖，通過上皮間質轉化（epithelialmesenchymal transition, EMT）等過程在分子轉錄水平、蛋白質修飾和細胞表型上的改變而變得具有侵襲性，從而利于逃離組織束縛進入循環系統，成為具有侵襲轉移能力的CTC[9]。研究[1-5]發現檢測肺癌CTC有助于早期診斷及判斷患者預后，與臨床分期有關，在治療期間定期檢測并監測CTC的變化，可為評價治療方案的敏感性提供依據，有利于開展個體化的治療。

2 肺癌CTC的檢測

現有分離、檢測肺癌CTC的技術方法較多且各有利弊。逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR）及其各種改進技術目前在肺癌CTC的檢測中應用最廣泛。RT-PCR檢測CTC是在PCR的基礎上擴增由腫瘤特異性mRNA序列逆轉錄的DNA片段，從而識別組織或腫瘤特異性mRNA的表達或某些基因改變后RNA水平的異常。由于這些特異性mRNA半衰期較短，在細胞死亡后會被RNA酶迅速降解，且通常不表達于正常外周血細胞中，所以在肺癌患者外周血中檢測到特異性mRNA可間接提示CTC的存在[10]。近些年新開發的熒光定量RT-PCR、巢式RT-PCR及實時定量RTPCR，雖提高了檢測的敏感性和特異性，但仍存在CTC計數障礙[11]，而Cell Search System[12]和CTC-chip[3]等新技術的應用，可進行肺癌CTC計數，便于實時監測，且不影響細胞活性，有利于下一步的分子生物學和遺傳學分析。

Cell Search System是基于免疫學的檢測方法，CTC用EpCAM抗體磁珠進行富集后，在一個外加強力磁場的作用下可從血液中被提取，對分離出來的CTC進行通透、固定，用DAPI熒光核染料、CD45熒光抗體和CK8、CK18以及CK19熒光抗體標記細胞，然后采用半自動四色熒光顯微鏡Cell-Spotter Analyzer檢測分析，符合腫瘤細胞學形態特征并且CK-PE+、DAPI+和CD45-的細胞被定義為CTC。此系統能從7.5 mL的全血中檢測到單一的腫瘤細胞。CTC-chip是近年來新出現的一種基于微流體學的檢測技術。它在一張與標準載玻片尺寸相同的硅片上面覆蓋8萬個顯微位點，每一個位點都包被上能夠捕捉CTC的抗體。當血液樣品通過微流芯片時，這些位點叢即可確保CTC在流過芯片前被捕獲。

3 肺癌CTC與早期診斷

肺癌的早期診斷對治療效果至關重要，早期發現及時治療是提高生存率的關鍵。研究[2,13]顯示CTC對肺癌早期診斷具有潛在的應用價值。目前，在無明顯臨床癥狀和轉移灶的I期患者體內也可檢測到CTC，說明現有臨床分期的早期就已存在肺癌細胞的播散[7]，并能在大量聚集后形成具有高度轉移潛能的循環腫瘤微栓（circulating tumor microemboli, CTM）。理論上使用基于腫瘤細胞大小的分離法（isolation by size of epithelial tumor cells, ISET）可對CTM進行富集[11]，這使未來對高危患者早期篩查協助診治成為可能。且目前已有學者借助于CTC對轉移性小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）早期做出診斷，Bevilacqua等[2]最初對1例患者肺組織穿刺活檢診斷為低分化神經內分泌瘤，但應用Cell Search System在外周血中檢測到EpCAM和CK陽性的CTC，然而EpCAM通常不表達于低分化神經內分泌瘤，其后對肝臟穿刺活檢發現肝內肺轉移灶，最后確診為EpCAM和CK陽性的SCLC。與目前的影像學、腫瘤標志物等相比，CTC在肺癌的早期診斷應用中尚處于起步階段，檢測CTC能否作為早期診斷的指標，還需進一步探討，但聯合多項檢查后的綜合判斷會提高臨床醫師診療的警惕性。

4 肺癌CTC與臨床分期

目前臨床上廣泛使用的肺癌分期方法仍以解剖學特征為基礎，但隨著分子機制在腫瘤生物學上的發展，近年來已有不少學者提出分子分期的概念[12]。有研究[13]發現直徑≤1 cm的腫瘤就已發生轉移，無臨床轉移病灶的I期肺癌中也可檢測到CTC[7]。雖然血液中檢測到CTC并不意味著一定存在轉移灶，但研究[1,7,14]顯示肺癌CTC與腫瘤分期具有明顯的相關性。Kurusu等[7]應用RT-PCR檢測103例手術治療的NSCLC患者外周血中的腫瘤組織特異性CEA mRNA，發現陽性率很大程度上與術前術后的臨床分期有關。Yie等[14]應用RT-PCR ELISA對143例NSCLC患者進行檢測，發現表達Survivin mRNA的CTC與腫瘤侵犯程度和淋巴結轉移狀態有關。Sher等[1]在其研究中也發現晚期肺癌患者CTC陽性率明顯高于早期患者，且CTC可作為TNM分期系統的有益補充。雖然尚不能將CTC迅速應用于仍以解剖學特征為基礎的肺癌分期系統，但以上研究提示CTC有潛力協助分期，結合影像學或病理學的檢查結果，更加綜合的反應患者當期病情。目前，盡管在外周血中檢測到CTC并不意味著體內一定存在微轉移灶，但有學者發現CTC在腫瘤的演變過程中存在進化，從原發部位向遠處器官擴散時會出現基因型的改變，可成為腫瘤原發部位和微轉移灶之間的橋梁，并能反應微轉移灶的性質[5,15]。這可彌補影像學和腫瘤標志物等檢查無法及時精確反映轉移灶性質的缺陷，對病情分期的評估和治療方案的制定都具有影響，從而選擇適宜的治療方式，避免過多的細胞毒性及治療方案的不足，在提高TNM分期準確性的同時對肺癌個體化治療的開展也具有一定的意義。

5 肺癌CTC與預后

對肺癌CTC的研究[4,15,16]顯示CTC具有重要的預后價值。Chen等[16]通過巢式RT-PCR法檢測行放化療的67例NSCLC患者，發現治療前CK19 mRNA陰性而治療后轉為陽性的患者的無進展生存期（progression free survival,PFS）和總生存期（overall survival, OS）均較短；在治療過程中CK19 mRNA持續陽性的患者預后最差。多變量分析顯示CK19 mRNA可作為NSCLC患者PFS和OS的獨立預測因子。Yoon等[17]應用巢式實時RT-PCR檢測79例NSCLC患者的TTF-1 mRNA，發現術后陽性患者的PFS比陰性患者較短，提示TTF-1 mRNA陽性的CTC與病情進展程度有關。Tanaka等[4]應用Cell Search System發現CTC數量在肺癌進展和轉移過程中增加，對監測病情變化和判斷預后具有重要意義。目前，已有大量研究顯示晚期肺癌患者CTC陽性率明顯高于早期患者，但CTC與肺癌預后的研究大都尚限于NSCLC，針對SCLC的研究較少，且肺癌CTC的檢測方法和使用的腫瘤標志物亦不同，所以關于CTC與肺癌的預后關系尚需病例數更多、設計更為嚴格的多中心臨床研究進一步證實。

6 肺癌CTC與治療

當前對肺癌的治療是基于腫瘤病理分級、患者一般狀況及腫瘤發展趨勢等因素之上的綜合治療。但遵循統一的診斷標準建立的治療方案缺乏個體化。隨著對CTC研究的深入發現其可反映腫瘤組織基因的表達變化，有助于監測療效及建立個體化的治療方案。

肺癌腫瘤組織基因的表達或突變可在治療過程中變化，從而導致藥物敏感性的改變，如耐藥基因T790M可導致對吉非替尼敏感的NSCLC治療失敗。Maheswaran等[5]應用CTC-chip檢測接受吉非替尼治療的NSCLC患者的CTC，發現CTC的基因突變與腫瘤組織具有高度一致性，同樣存在EGFR突變（T790M），且在治療過程中監測發現CTC數量的改變可以反映患者病情的變化趨勢和治療的療效。在這之前，Nagrath等[3]對9例NSCLC患者的研究結果與之相似，發現在評估化療的療效上CTC數量的改變與按照實體瘤的療效評價標準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST）進行CT影像學檢查的結果具有高度一致性。Bepler等[18]對30例接受吉西他濱方案治療的局部進展期NSCLC患者跟蹤隨訪，發現RRM1 mRNA的表達與療效呈負相關，即吉西他濱對高表達者療效差，對低表達者療效好。Wu等[19]應用Cell Search System對12例化療2個療程的肺癌患者跟蹤隨訪，也發現CTC數量與化療后影像學的應答存在關系，提示CTC可實時監測化療肺癌患者的療效。

總之，CTC對肺癌個體化治療有潛在的重大意義，有望依靠非侵入性的血液檢測獲悉當前治療的療效，起到實時監測的作用，從而利于臨床醫師及時調整治療策略，達到個體化治療目的，但能否替代原發組織標本指導分子靶向治療，并對服用吉非替尼等分子靶向藥物治療進行實時監測及避免耐藥基因的出現而影響療效，尚需通過大規模的前瞻性研究來證實。

7 展望與結語

伴隨現代生物學技術的發展，CTC檢測的敏感性和特異性均明顯提高，使探討其臨床應用價值成為可能。2004年Cell Search System已被美國食品藥物管理署（FDA）批準進入臨床，但只限于預測轉移性乳腺癌（metastatic breast cancer, MBC）、前列腺癌和結直腸癌的PFS和OS的應用，而未能臨床應用于肺癌。對于MBC、前列腺癌和結腸癌而言，CTC已被認為是一種可靠的預后指標，能在治療過程中預測病情的進展和患者的生存時間；而監測結果能更早地為臨床醫師提供更豐富的信息，從而有利于制定更明確的治療方案。37%MBC、57%前列腺癌、30%結腸癌患者外周血樣本中都可以檢出≥2個CTC，而健康志愿者和非惡性腫瘤患者外周血樣本中幾乎沒有這種現象[20]。

2007年Nagrath等[3]率先報道了CTC-chip比Cell Search System分離純度高出兩個數量級，更有利于分子生物學檢測。為能將CTC用于肺癌的日常臨床工作，尚需通過大規模、多中心的研究建立快速、靈敏、精確的檢測方法。目前，肺癌CTC的檢測及臨床應用還沒有一致的標準，但從以上理論和已有的研究結果來看，CTC至少具有以下幾點潛在應用價值，即在早期患者中發現隱匿性微轉移、監測肺癌患者病情進展和評價患者對治療的反應。

2009年美國臨床腫瘤協會（ASCO）大會上就有學者高度強調CTC在癌癥患者中的重要應用價值，認為CTC可作為實時液體活檢和臨床常規檢測中較為理想的標本來源。對肺癌CTC的進一步研究將有助于闡明肺癌的生物學特性，在肺癌未來的綜合診治中可能將更多的考慮CTC的存在及其特性，相應檢測有望成為肺癌患者的臨床常規檢查，為患者帶來福音。