Nrf2在腫瘤化學防御方面的研究進展

閆惠琴 馬力 周清華

誘導正常細胞產生各種抗氧化酶、金屬結合蛋白、藥物代謝酶、藥物轉動蛋白及分子伴侶是防止腫瘤發生的有效措施之一。Nrf2（NF-E2-related factor 2）是腫瘤化學防御的一個重要細胞保護因子。許多細胞保護基因啟動子區均有抗氧化反應元件ARE（antioxidant response element, ARE），Nrf2通過與細胞保護基因的ARE序列結合調節基因表達。正常條件下Nrf2位于細胞質，與氧化還原敏感性底物Keap1（Kelch-like ECH-associated protein 1）形成結合物并迅速通過泛素化途徑降解。腫瘤化學誘導劑使Keap1巰基氧化后使Nrf2從Nrf2-Keap1結合物中釋放并轉入細胞核，誘導各種細胞保護基因表達。本文旨在對Nrf2轉錄因子近幾年在腫瘤化學防御方面的研究進展加以綜述。

1 腫瘤化學防御劑分類及作用

腫瘤的發生是多因素多階段的復雜過程。通過誘導細胞保護蛋白調節致癌物質的代謝或分布是預防腫瘤的最有效措施之一。腫瘤化學防御劑可分為阻斷劑（blocking agents）和抑制劑（suppressing agents）[1]。腫瘤化學防御劑可以是藥物也可以是天然產品。其作用是防止正常細胞向腫瘤細胞的轉化、抑制腫瘤細胞的啟動或干擾前腫瘤細胞向惡性腫瘤細胞進展。一個好的腫瘤化學防御劑應該在正常細胞向腫瘤轉化和啟動階段阻止各種內外界致癌物對DNA的損傷及修飾，停滯或逆轉腫瘤的啟動，在惡性腫瘤發生之前清除前惡性腫瘤細胞及相關有害物質。阻斷劑的作用是抑制致癌物活化，增強已活化的致癌物的清除，誘捕其活性中間物的產生，加強DNA修復[2]。抑制劑的作用是抑制已轉化的腫瘤細胞進一步惡化[3]。腫瘤化學防御劑可產生一定的活性氧族（reactive oxygen species, ROS）或親電性物質，在細胞內產生一定程度的氧化應激[4]。這種輕微的氧化應激可有效地啟動各種信號傳導途徑，誘導II相解毒酶、III相轉運蛋白及各種抗氧化酶，從而激活抑癌基因的表達、抑制細胞增殖及血管生成[5]。研究發現多種腫瘤化學防御劑可活化Nrf2信號傳導通路，通過轉錄因子Nrf2介導的抗氧化和抗炎作用防止腫瘤的發生。

2 Nrf2轉錄因子

Nrf2屬于CNC-bZIP（cap'n'collar and basic leucine zipper）家族，位于染色體2q3.1，長約2.4 kb，是一個氧化還原敏感性的轉錄因子，富集于解毒反應最常發生的腸、肺和腎臟中[6]。通過Nrf2激活細胞的各種生存途徑，參與抗氧化、抗炎、免疫反應、凋亡及腫瘤發生等多種生物進程[7]。Nrf2正性調節各種抗氧化劑、內外源性解毒酶和ATP依賴性耐藥泵基因的表達[8,9]，保護正常細胞免受氧化應激和各種內外源性有毒物質的損傷。Nrf2也可被MAPKs、PKC、PI3K及PERK等蛋白激酶磷酸化后激活，從Keap1結合物中解離轉入細胞核調節各種靶基因的表達[10]。Nrf2-Keap1系統是機體氧化應激反應的一級防御體系[11]。正常條件下，Nrf2在胞漿內與抑制因子Keap1結合形成復合物，處于非活化狀態。當內外源性毒性物質使Keap1的巰基氧化后，Nrf2從Nrf2-Keap1結合體中解離進入細胞核，與小Maf蛋白形成異二聚體識別ARE，表達目的基因，保護細胞特別是肺部組織細胞免受氧化損傷。Keap1決定Nrf2在細胞質和細胞核之間的穿梭與降解。Keap1缺失或變異導致Nrf2在細胞核中聚集，持續激活細胞保護基因的轉錄[12]。

3 Nrf2轉錄因子的調控

Nrf2是主要的ARE結合轉錄因子之一。各種腫瘤化學防御化合物高度依賴于Nrf2蛋白，通過激活Nrf2增加細胞的各種解毒酶及抗氧化酶活性，清除致癌物并阻止腫瘤的發生。有推測組成性表達Nrf2會使機體抵抗并耐受應激，維護機體健康，但事實并非如此。Nrf2的表達受各種因素的制約。它受體內外多種因素的誘導如過氧羥自由基、類胡蘿卜素、醌類、聯苯酚、邁克爾反應受體、異硫氰酸酯、重金屬類、二硫化合物、血紅素、NO、前列腺素和各種生長因子等因素的影響[13]。在正常生理條件下Nrf2與Keap1形成化合物迅速被泛素化并降解為26S蛋白酶。Keap1作為Nrf2和E3泛素連接酶的橋梁，導致Nrf2結構域中多個賴氨酸泛素化。Keap1使Nrf2轉錄因子泛素化依賴性的降解并可抑制Nrf2靶基因的表達[14]。Keap1既可以在細胞質內也可以在細胞核內將Nrf2降解[15]。這可能是防止氧化應激時Keap1依賴性地將Nrf2在細胞質或細胞核內降解，導致Nrf2在核內的聚集。核內聚集的或穩定的Nrf2方可與ARE序列結合，進而與Maf小蛋白分子結合啟動Nrf2靶基因的表達。

4 Keap1對Nrf2的調控

Keap1位于染色體19p13.2上，長2.6 kb。Keap1決定Nrf2在細胞質細胞核之間的穿梭與降解。Keap1缺失導致Nrf2在細胞核中組成性地聚集，激活細胞保護基因的轉錄。Keap1在正常情況下通過泛素26S溶酶體途徑調節Nrf2降解。最近的研究[16]表明Keap1靶向作用于Cul3的E3連接酶使Nrf2泛素化。Keap1通過防止Nrf2在核中聚集并增加溶酶體降解速率負性調節Nrf2。Keap1是一個富含半胱氨酸的蛋白，其中的27個半胱氨酸殘基作為感受器可探測氧化劑和外源性物質。C257、C273、C288和C297殘基可與Nrf2的N未端的Neh2結構域相互作用。其中C273和C288的變異會消除Keap1對Nrf2的抑制作用[17]。有研究[18]表明Cys151點突變為Ser不可逆地抑制Nrf2，用氧化應激因子處理后低表達或不表達ARE驅動的基因。而在Keap1-/-小鼠體內敲入Keap1C151S則恢復ARE驅動的基因的表達[19]。值得注意的是在體內或體外Keap1的活性半胱氨酸都可被外源性的親電性物質所修飾。Keap1作為氧化應激敏感性的分子開關，負性調控Nrf2靶基因的表達。

5 Nrf2調控的靶基因

通過轉錄因子Nrf2可誘導藥物代謝酶和抗氧化蛋白。Nrf2化學誘導劑的主要作用在于調節各種致癌物的吸收、分布、代謝、排泄及抗炎反應。慢性炎癥反應是腫瘤發生的一個危險因子，腫瘤化學防御劑的作用其中就包括Nrf2的抗炎反應。Nrf2-Keap1系統的靶基因主要有4個方面[13]，包括①II相解毒酶，如：谷胱甘肽硫轉化酶（glutathione S-transferases, GSTs）、醌氧化還原酶（quinone oxidoreductase, NAD(P)H）、UDP-葡萄糖醛酸轉移酶1A6（UDP-glucuronyl transferase 1A6）、黃曲霉毒素B1醛還原酶（aflatoxin B1 aldehyde reductase）及微粒體環氧化物水解酶（microsomal epoxide hydrolase）；②抗氧化蛋白，如血紅素氧化酶（hemeoxygenase-1, HO-1）、過氧化酶1（peroxiredoxin 1）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase）、 過氧化物岐化酶（superoxide dismutase）及硫氧還蛋白（thioredoxin）等；③GSH生成酶，如γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase, γ-GCS）調節并維持細胞內GSH水平；④ III相轉運蛋白。

6 誘導Nrf2的腫瘤化學防御劑

Nrf2轉錄因子的主要誘導劑有類胡羅卜素、異硫氰酸酯、砷衍生物、邁克爾反應受體、前列腺素及各種生長因子等[13]，同時也包括誘導其靶基因血紅素氧化酶的一系列腫瘤化學防御劑如姜黃素（curcumin）、萊菔硫烷（sulforaphane）、鼠尾草酚（carnosol）及白藜蘆醇（resveratrol）等化合物[20]，這些化合物均通過活化轉錄因子Nrf2誘導HO-1基因及蛋白的表達。細胞的生存取決于細胞或組織對應激的耐受、修復及對損傷分子或轉化細胞的清除。對正常細胞而言活化Nrf2誘導HO-1的表達起到防御腫瘤發生的作用。然而有研究[21]報道與癌旁組織相比，肺癌、腺癌、黑色素瘤、胰腺癌及腦瘤等多種腫瘤組織中HO-1為高表達。HO-1及其代謝產物具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、促血管生成及促腫瘤侵襲轉移的作用。表明HO-1既能保護正常細胞向腫瘤細胞轉化，又能保護腫瘤細胞在惡劣的氧化應激環境中生存。對腫瘤細胞而言誘導HO-1表達會促進腫瘤的生長及惡化，提示腫瘤化學防御藥物應用應謹慎，腫瘤化學防御藥物并非都具有抑制腫瘤生長及惡化的作用。