重組桿狀病毒殺蟲劑的研究現(xiàn)狀與展望

孫興魯 黃艷君 朱 江 浦冠勤

(1蘇州大學金螳螂建筑與城市環(huán)境學院，江蘇蘇州 215123; 2蘇州大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學與生物科學學院，江蘇蘇州 215123)

利用昆蟲桿狀病毒(baculovirus)防治害蟲是生物防治的一項重要內容，但與化學殺蟲劑相比，野生型桿狀病毒的殺蟲譜窄、殺蟲速度慢，局限了其在生物防治中的應用。針對野生型桿狀病毒殺蟲速度慢的不足，可通過現(xiàn)代分子生物技術對其進行改造，以加快其殺蟲速度，從而構建出重組型的桿狀病毒。1986年，英國牛津大學的Bishop等［1］首先開始進行應用昆蟲專一性毒素基因重組桿狀病毒增強病毒殺蟲效果的試驗。20世紀80年代末期以來，重組桿狀病毒殺蟲劑的研制成為生物防治領域的熱點。

目前，構建重組桿狀病毒殺蟲劑的主要技術路線有3條［2］:一是鑒定并去除某種非必需基因來增加殺蟲效果;二是插入某些外源基因以提高殺蟲速度;三是通過修飾、缺失與宿主范圍相關的基因來拓寬病毒的殺蟲譜。其中插入外源基因是目前構建重組病毒殺蟲劑最主要的方法。例如，將對昆蟲特異性的毒素基因，調控昆蟲代謝、發(fā)育的基因及某些酶基因等外源基因，插入昆蟲病毒基因組以構建重組病毒殺蟲劑，提升控制宿主的效率。目前，采用較多的外源基因有螨蟲毒素［3］、蝎子毒素［4］、海葵毒素［5］、蜘蛛毒素［6］、蘇云金毒素［7］等。插入的外源基因大致可分為2種類型，一類為昆蟲激素類物質，能破壞害蟲的正常生長，干擾昆蟲體內的生理代謝;另一類是細菌和昆蟲毒素，其機制是通過毒素作用，使害蟲提早停止進食或死亡。除了插入外源基因，還可通過刪除、修飾昆蟲病毒基因組內的某些基因，以增強病毒的殺蟲效率或擴大病毒的宿主域，提高昆蟲病毒的殺蟲作用。如:蛻皮甾體葡萄糖基轉移酶(egt)基因是桿狀病毒編碼，能對宿主蛻皮激素進行糖基化修飾，使蛻皮激素失活或從宿主體內清除，從而推遲幼蟲入眠［8］;刪除egt基因可加速宿主昆蟲的死亡［9］。本文概述了插入幾種外源基因重組昆蟲桿狀病毒的研究狀況，同時對重組病毒的發(fā)展前景作了展望。

1 北非蝎毒素重組桿狀病毒

昆蟲特異性神經(jīng)毒素AaIT來源于北非蝎子(Androctonus australis)，是由70個氨基酸組成的多肽，它對鱗翅目特別是夜蛾科的一些重要農業(yè)害蟲有毒殺作用，且殺蟲效率很高。它是昆蟲重組桿狀病毒研究中采用最多，也最為成功的一類外源毒素，最早由Stewart等［10］重組入苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus，簡稱AcMNPV)，與野生型AcMNPV對粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)幼蟲的殺蟲效果進行比較，3 d內重組AcMNPV比野生型AcMNPV的半存活時間(ST50)縮短50%，甘藍葉面積的受害率降低50%。

姚斌等［11］將人工合成的 AaIT基因與膜蛋白gp64信號肽編碼序列融合后通過與AcMNPV同源重組，構建了1株既能表達AaIT毒素又能形成包涵體的重組粉紋夜蛾核型多角體病毒(Trichoplusia ni nuclear ployhedrosis，簡稱 TnNPV)，命名為 vTn-AaIT。受感染昆蟲在2～3 d內麻痹，停止危害作物，而病毒在昆蟲體內繼續(xù)增殖，最后蟲體液化死亡。該重組TnNPV保留了多角體的啟動子和結構基因，表達量約為 P10蛋白的70%;使用該重組TnNPV對棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、粉紋夜蛾、苜蓿銀紋夜蛾等3～4齡幼蟲進行生物測定，結果表明:殺蟲時間可由野生型TnNPV的5～7 d，縮短至2～3 d，半致死時間(LT50)縮短近50%，而且使蟲體致死的劑量也顯著降低，這是我國構建成功的第1株有實際應用價值的基因工程殺蟲病毒。

2 蘇云金桿菌毒蛋白重組桿狀病毒

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種昆蟲病原微生物，其主要的殺蟲活性物質稱為殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal protein，簡稱ICP)。研究與實踐證明［12］:蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等500多種昆蟲及線蟲等有毒殺活性。蘇云金內毒素(Cry1Ac)編碼的殺蟲晶體蛋白是Bt產生的多種殺蟲晶體蛋白中對鱗翅目昆蟲有很高毒性的蛋白。Cry1Ac殺蟲晶體蛋白的殺蟲作用是毒素與昆蟲中腸細胞上的專一性受體蛋白相互作用，并在細胞膜上形成孔道而實現(xiàn)的［13］。大量的研究數(shù)據(jù)表明［14］，Cry1 類毒素之間的結構域交換可以改變毒素的殺蟲譜，影響原毒素的結構、穩(wěn)定性和晶體的形成，甚至影響整個毒素的毒力。2003年Jin Hee Chang等［7］構建了含蘇云金內毒素晶體蛋白基因的重組型AcMNPV;該病毒可產生多角體與Bt毒素蛋白以及綠色熒光蛋白的融合蛋白;經(jīng)生物測定:重組型AcMNPV的半致死劑量(LD50)與ST50大大降低，LD50由野生型病毒的2798.3個多角體降為28.3個多角體，ST50由野生型病毒的92.8 h降為33.9 h，極大地提高了病毒的殺蟲效率。

3 幾丁質酶重組桿狀病毒

幾丁質酶(chitinase)是一類具有生物催化活性的水解酶，可降解昆蟲體內幾丁質，而幾丁質是昆蟲體壁和中腸圍食膜的主要組分，體壁和圍食膜又是蟲體抵御不良環(huán)境和外來生物侵染的重要屏障［15］，因此幾丁質酶在害蟲生物防治中愈來愈受到人們的重視。桿狀病毒幾丁質酶基因(chitinase gene，簡稱ChiA)是桿狀病毒晚期表達的非必需基因，高度保守。在害蟲生物防治中，桿狀病毒ChiA可直接作為殺蟲劑，或在病毒基因組中插入外源ChiA，增強重組病毒的殺蟲活性［16］。范曉軍等［17］將蝎毒素、幾丁質酶與AcMNPV基因組同源重組的重組病毒(AcMNPV BmKIT ChiA)和野生型病毒作比較發(fā)現(xiàn)，兩者的半致死濃度(LC50)分別為7.5×102、3.3×104PIBs/mL(個多角體/mL)，重組病毒比野生型病毒具有更好的殺蟲活性。

4 egt基因的缺失

桿狀病毒egt基因通過一種糖基化作用使宿主昆蟲分泌的蛻皮激素失活，以延長幼蟲的取食時間，有利于桿狀病毒的大量繁殖［8］。因此，推測桿狀病毒基因組中egt的保留是其在鱗翅目昆蟲寄主中長期進化的結果。egt基因編碼蛻皮甾體脲苷二磷酸葡糖轉移酶是桿狀病毒非必需的早期基因，同時也是昆蟲病毒中迄今已知的唯一在個體水平調控感染宿主的基因［18］。刪除egt基因不影響病毒在細胞中的復制，但egt基因的缺失可以縮短被感染昆蟲的致死時間，提高殺蟲效果，減少作物的受害程度。O'Reilly等［19］首先構建出缺失 egt的 AcMNPV，他們發(fā)現(xiàn)這種重組病毒感染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)幼蟲的死亡速度比野生型快30%。Flipsen等［20］用缺失 egt基因的 AcMNPV感染甜菜夜蛾(Spodptera exigua)幼蟲時發(fā)現(xiàn)，幼蟲的馬氏管提前被破壞，而感染野生病毒的幼蟲的馬氏管沒有變化，據(jù)此推測:幼蟲馬氏管的退化是egt基因的缺失對蛻皮激素調節(jié)的結果。

5 擴大重組桿狀病毒的宿主域

桿狀病毒大都具有很窄的宿主域，作為殺蟲劑，一方面，窄的宿主域可保證非靶標昆蟲的安全，利于保護生態(tài)平衡;另一方面，卻限制了桿狀病毒殺蟲劑的使用，我們希望一種殺蟲劑可以作用于多種害蟲。有關桿狀病毒宿主域決定機制的研究在分子水平上，目前仍在探索中。AcMNPV與家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，簡稱BmMNPV)基因組的核苷酸序列同源性為93%［21］;盡管二者同源性關系很近，但宿主域卻完全不同。AcMNPV和BmMNPV共同感染昆蟲細胞，可產生新的重組病毒，其宿主范圍較2個親本有所拓寬。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)位于BmMNPV解旋酶基因內的79 bp序列，可在體外擴大AcMNPV的宿主域;在該79 bp序列區(qū)域中，AcMNPV和BmMNPV有6個位點不同，AcMNPV基因組中在解旋酶蛋白的3個特異性氨基酸被相應的3個BmMNPV特異性氨基酸替代后，其宿主范圍可擴展到家蠶幼蟲［22］。

6 重組桿狀病殺蟲劑的研究與展望

目前昆蟲桿狀病毒殺蟲劑還無法取代化學殺蟲劑，但其所擁有的對脊椎動物安全、不污染自然環(huán)境等優(yōu)點是化學殺蟲劑所不具備的。桿狀病毒作為殺蟲劑具有十分廣闊的應用前景，桿狀病毒殺蟲劑在解決了自身的缺點(如作用速度慢、宿主域窄等)后將會獲得良好的發(fā)展。目前，對野生桿狀病毒進行改良，獲得重組桿狀病毒是昆蟲桿狀病毒殺蟲劑研制的主要方向。重組桿狀病毒殺蟲劑的研究重點集中在桿狀病毒的基因工程，如尋找并插入合適的外源基因、刪除桿狀病毒非必須基因以及不同啟動子的運用。由于基因發(fā)生了改變，產生了自然界原本不存在的重組桿狀病毒，重組桿狀病毒的生物安全性尚需長時間的深入研究，這也是目前重組桿狀病毒生物殺蟲劑很少被批準進入環(huán)境釋放、商業(yè)化生產與應用的原因。

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