昆蟲與哺乳動物蛋白質 N-糖基化修飾異同的比較及其潛在的應用意義

韋亞東 牛淼淼 劉子瑜 車鳳玉 張國政

(1江蘇科技大學,江蘇鎮江 212018; 2中國農業科學院蠶業研究所,江蘇鎮江 212018)

昆蟲與哺乳動物蛋白質 N-糖基化修飾異同的比較及其潛在的應用意義

韋亞東1,2牛淼淼1劉子瑜1車鳳玉1張國政1,2

(1江蘇科技大學,江蘇鎮江 212018;2中國農業科學院蠶業研究所,江蘇鎮江 212018)

基于過去多年來所積累的關于昆蟲蛋白質糖基化修飾的研究成果,對昆蟲與哺乳動物的蛋白質 N-糖基化修飾途徑與分子機制的異同進行了比較分析,同時進一步討論如何在人們前期研究的基礎上,對昆蟲桿狀病毒表達系統的蛋白質糖基化修飾途徑做些改造性工作,以期能夠直接利用該昆蟲桿狀病毒表達系統生產人源化糖蛋白。

昆蟲;哺乳動物;桿狀病毒;表達系統;N-糖基化修飾;人源化糖蛋白

自 20世紀 80年代以來,人們對昆蟲桿狀病毒表達系統進行了全面的研究并表達了大量的重組蛋白［1］。該表達系統包括作為表達載體的重組病毒和作為病毒繁殖宿主的昆蟲細胞或蟲體,外源基因的表達是利用重組病毒非常強的病毒晚期基因啟動子,如 polyhedrin或 p10等,協同病毒轉錄復合體完成的［2］。基于該表達系統除了能夠以非常高的水平表達外源基因外,還能夠容納很大的外源基因的插入表達,是一個很好的表達多亞基功能蛋白的平臺［3］。同時,對人或動物具有相對的生物安全性。因此,人們逐漸把它作為基因治療及應用該系統將外源基因引入哺乳動物細胞或組織的重要工具［4］。

在昆蟲桿狀病毒表達中,當病毒載體進入宿主細胞,宿主自身的基因表達基本上全面停止,細胞內的蛋白質合成系統轉向合成表達病毒基因,包括插入的外源基因。作為桿狀病毒宿主的昆蟲是真核生物,細胞能夠以多種復雜的方式對合成的蛋白質進行后修飾,表達的重組蛋白在細胞內被折疊、修飾、運輸組裝成最終的功能蛋白［5］。其中,N-糖基化是蛋白質翻譯后修飾中非常重要的一種,與蛋白質的正確折疊、生物半衰期及生物功能正常發揮息息相關。目前的研究結果表明,昆蟲的糖基化修飾和高等動物的不同［6］。哺乳動物的糖蛋白是具有唾液酸末端的雜合型 N-糖鏈構型,而昆蟲細胞表達的糖蛋白糖鏈具有非常簡單的側鏈,是低甘露糖型,并且含有對人類具有過敏反應［7］的核心 α-1,3連接的巖藻糖。這些糖鏈結構的差異,極大地限制了昆蟲桿狀病毒表達系統在人類醫藥上的應用。因此,正確認識、分析比較昆蟲與哺乳動物的蛋白質 N-糖基化修飾途徑及其分子機制的不同,對改造昆蟲桿狀病毒表達系統糖基化修飾途徑,表達人源化糖蛋白具有非常重要的必要性。本文對昆蟲與哺乳動物蛋白質 N-糖基化修飾途徑中的糖鏈修飾的起始、核心糖鏈剪接加工、側鏈巖藻糖化、核心糖鏈分枝與延長及其分子機制異同進行比較分析如下。

1 昆蟲和哺乳動物糖蛋白的 N-糖鏈修飾的起始及核心糖鏈剪接加工的差異

真核生物的蛋白質糖基化修飾過程通常在內質網和高爾基體內進行的。初始階段,事先在一系列酶的作用下組裝好的寡糖復合前體,轉運到新生肽的糖基化保守序列的氨基酸上。隨后的初始糖鏈在糖苷酶的作用下進行糖鏈的剪切和在糖基轉運酶作用下的糖鏈加工,形成了一個小的糖鏈核心結構。在不同的物種中,這個糖鏈核心結構能夠通過不同的后續途徑,進一步分枝和延長成最終的成熟糖蛋白的帶有側鏈的寡糖糖鏈。N-糖鏈修飾的起始及核心糖鏈的形成,在昆蟲和哺乳動物細胞內的途徑是基本一致和相似的［8］。

研究比較清楚的哺乳動物的蛋白質糖基化過程是起始于寡糖轉運酶的作用。寡糖轉運酶是存在于內質網中的一個多亞基的蛋白酶,它將事先組裝好的 Glc3Man9GlcNAc2寡糖,從寡糖載運脂體轉運至新生肽的糖基化識別位點(Asn-X-Thr/Ser)上［9］。緊接著內質網膜上的 α-葡萄糖苷酶 I,將最外末端的 α-1,2連接的葡萄糖去除掉［10］。另外的內質網膜上的 α-葡萄糖苷酶 II去除掉第 2個 α-1,3連接的葡萄糖,形成剩有 1個葡萄糖的核心 GlcMan9Glc-NAc2［11］,這個酶的后繼作用將最后剩下的 α-1,3連接的葡萄糖從 GlcMan9GlcNAc2上去除掉,形成保守的高甘露糖型的 N-糖鏈構型Man9GlcNAc2。這個結構的糖鏈既可能是某些糖蛋白的最終糖鏈構型,也可能是某些糖蛋白糖鏈形成的中間物。

隨后糖鏈 Man9GlcNAc2中甘露糖的剪切加工,是在位于內質網和高爾基體內分屬于 Class I和Class II的 α-甘露糖苷酶作用下進行的［12］。α-甘露糖苷酶的協同作用從 Man9GlcNAc2上去除掉所有 4個 α-1,2甘露糖,最終形成非常重要的中間核心體Man5GlcNAc2。這個作用過程包括 2個內質網 α-甘露糖苷酶 I和 α-甘露糖苷酶 II及 3個高爾基體內的 α-甘露糖苷酶 IA、α-甘露糖苷酶 IB及 α-甘露糖苷酶 IC［13］。內質網 α-甘露糖苷酶 I是一個作用比較慢的酶,其只能專一性地去除中間支鏈的末端甘露糖,形成 Man8GlcNAc2異構體 B。同樣,內質網 α-甘露糖苷酶 II也只能從 Man9GlcNAc2上去除掉一個末端的 α-1,3支鏈的甘露糖,最終形成 Man8Glc-NAc2異構體 C［14］。緊接著的 3個α-1,2連接的甘露糖分別被高爾基體 Class I的 3個 α-甘露糖苷酶去除掉,他們分別有自己特殊的底物構型偏好。

Man5GlcNAc2是蛋白質 N-糖基化修飾過程中非常重要的核心糖。在不同物種中,該核心糖在高爾基體的一些糖苷酶作用下,最終形成具有物種特性的高甘露糖構型、雜合型或復合型構型［15］。雜合構型的 N-糖鏈的末端 α-1,3連接的甘露糖被N-乙酰氨基葡糖代替,但保留 α-1,6連接的甘露糖。復合構型的 N-糖鏈的 2個 α-1,3連接的甘露糖和 α-1,6連接的甘露糖均被 N-乙酰氨基葡糖所代替。

昆蟲的蛋白質 N-糖基化修飾的起始和哺乳動物類似,就是一同將寡糖前體物從 Glc3Man9Glc-NAc2-PP-Dol轉移到新生肽鏈的 N-糖基化位點的天冬酰胺上［7］。這個結論已經被昆蟲細胞中的 N-糖鏈和脂質體連在一起所證實［16］。昆蟲和哺乳動物細胞內從 Glc3Man9GlcNAc2去除掉末端的葡萄糖的途徑也是一致的,但昆蟲體內編碼 α-葡萄糖苷酶 I和 α-葡萄糖苷酶 II的基因還沒有被克隆出來,不過通過酶抑制劑［17］和 N-糖鏈的分析［18］,能夠證實鱗翅目昆蟲細胞存在這 2個酶的活性。另外,在鱗翅目昆蟲中也已證實了與甘露糖剪切加工相關的 α-甘露糖苷酶存在［19］。

2 昆蟲和哺乳動物中糖蛋白 N-糖鏈巖藻糖化的異同

昆蟲和哺乳動物體內都存在核心 α-1,6巖藻糖轉運酶,這個酶可以在連接天冬酰胺的 GlcNAcMan3GlcNAc2的 N-乙酰氨基葡糖殘基上,加上 α-1,6連接的巖藻糖。昆蟲的糖基化進程隨后在 Class II甘露糖苷酶的剪接加工和核心 α-1,6巖藻糖化后,就與哺乳動物徹底不同了［20］。

特殊的是,昆蟲細胞內的巖藻糖轉運酶能夠將共同中間體 GlcNAcMan3GlcNAc(α1,6Fuc)GlcNAc,修飾成一個核心 α-1,3巖藻糖化的 N-糖鏈［21］。這個核心 α-1,3巖藻糖轉運酶嚴格需要核心α-1,6巖藻糖轉運酶的優先作用［22］,并且已經知道其產物的N-糖鏈對哺乳動物產生過敏反應［23］。另一個重要的不同是有些昆蟲細胞具有膜錨定的β-N-乙酰氨基葡糖苷酶活性,這種酶活性在線蟲［24］和一些植物［25］中也有發現。它能夠特異地從 GlcNAcMan3GlcNAc(±α1,3/6Fuc)GlcNAc移除末端的 N-乙酰氨基葡糖殘基［26］。因此,昆蟲的主要 N-糖鏈產物Man3GlcNAc(±α1,3/6Fuc)GlcNAc一般被叫做低甘露糖構型,這些低甘露糖構型的N-糖鏈不能進一步延長。

3 昆蟲和哺乳動物糖蛋白的核心糖鏈分枝與延長

在哺乳動物細胞內,Man5GlcNAc2轉化為 N-糖鏈的雜合型或復合型結構是由高爾基 N-乙酰氨基葡糖轉運酶 I(GlcNAc-TI)起始的,它把 1個N-乙酰氨基葡糖殘基,以 β-1,2鍵轉運到 α-1,3支鏈的甘露糖上,形成 GlcNAcMan5GlcNAc。這個中間體可以以很多途徑轉化為雜合構型,其中 N-乙酰氨基葡糖轉運酶 III(GlcNAc-TIII)就可以在單酶的情況下,將該中間體最終轉變為雜合型的糖鏈。這個酶能夠在中間的 β-1,2連接的甘露糖上添加 1個 N-乙酰氨基葡糖,阻斷了隨后的高爾基 α-甘露糖苷酶 II的作用［27］。正常情況下,高爾基 α-甘露糖苷酶 II完成最后的甘露糖修剪作用,去除 GlcNAcMan5GlcNAc2上的 α-1,2和 α-1,6連接的甘露糖殘基,生成中間體GlcNAcMan3GlcNAc2［28］。高爾基 α-甘露糖苷酶II的作用要求必須優先在 Man5GLcNAc2的 α-1,3支鏈上,用 GlcNAc-TI加上 1個 N-乙酰氨基葡糖殘基。

在 GlcNAcMan5GlcNAc2的 α-1,3支鏈上,優先加上 N-乙酰氨基葡糖,也是 α-1,6海藻糖轉運酶形成核心海藻糖化的前體條件,它是轉運 1個α-1,6連接的海藻糖殘基到直接和天冬酰胺連接的 N-乙酰氨基葡糖上［29］。所以,海藻糖化的核心 GlcNAc-Man3GlcNAc(Fucα1,6)GlcNAc是通過 N-乙酰氨基葡糖轉運酶 I、高爾基 α-甘露糖苷酶 II和核心 α-1,6海藻糖轉運酶協同作用的結果。

另 1個高爾基 N-乙酰氨基葡糖轉運酶 II(Glc-NAc-TII),通過在 GlcNAcMan3GlcNAc(±Fucα1,6)GlcNAc的末端 α-1,6連接的甘露糖上,添加β-1,2連接的 N-乙酰氨基葡糖,形成第 1個復合型的糖鏈［27］。高爾基 α-甘露糖苷酶 II和核心 α-1,6海藻糖轉運酶一樣,GlcNAc-TII也需要和 GlcNAc-TI一樣的優先添加反應［30］。GlcNAc-TI和 GlcNAc-TII酶廣泛存在于各種組織和細胞中,它們啟動了 N-糖鏈的 2個支鏈的延伸,形成最終的雙天線 N-糖鏈構型。另外的支鏈可以由 1個或多個 N-乙酰氨基葡糖轉運酶啟動,包括 GlcNAc-TIV、GlcNAc-TV和 GlcNAc-TVI。在這些酶的作用下,最終產生四、五或者六天線的 N-糖鏈,但它們多嚴格限制在某些組織或惡性腫瘤里。

有末端 N-乙酰氨基葡糖的 N-糖鏈能夠被 1個或多個高爾基體 β-1,4半乳糖轉運酶(β4GalTs)進一步延長,這至少需要 7種人基因編碼的酶和各種特殊的受體底物［31］。其中 β4GalTI到 VI參與糖蛋白或糖脂的生物合成［32］,但 β4GalT-VII僅參與蛋白聚糖的生物合成［31］。

在哺乳動物細胞內,末端半乳糖化的糖鏈的都加上 α-2,3,α-2,6及 α-2,8連接的唾液酸。人類基因組上編碼多于 20種不同的唾液酸轉運酶,其中15種已經被克隆和研究［33］。這些唾液酸轉運酶都是高爾基體的 II型轉膜糖蛋白,具有 3個一致的 L、S和 VS區域［34］。不同的唾液酸轉運酶作用不同的唾液酸連接鍵,并有不同的特殊受體底物。唾液酸化在很多生物過程中起重要的作用,如神經系統的發育、糖蛋白及紅細胞循環的翻轉、病原和宿主的相互作用和免疫系統功能等,它們還和惡性腫瘤的擴散及癌變有關系［35］。從藥物應用角度來改造重組糖蛋白時,應該考慮到唾液酸化,因為它能夠在哺乳動物細胞循環系統里,保護糖蛋白不被清除。這可以明顯增加糖蛋白藥物的藥物代謝動力學和它的藥物療效［36］。

人們普遍認為昆蟲沒有末端糖鏈轉運酶或者唾液酸代謝機制［37］,昆蟲的 N-糖鏈形成途徑被認為只能限制形成低甘露糖的糖鏈構型。但事實并非如此,現在一些生物化學的、組織化學的、結構學的及分子遺傳學的證據表明,至少某些昆蟲具有一些潛在的進一步延長末端唾液酸化糖蛋白的 N-糖鏈的能力。特別是近來果蠅基因組的生物信息學研究表明,昆蟲具有很多哺乳動物 N-糖鏈分枝、延伸及唾液酸化的基因,并且這些基因產物潛在的生物化學功能已被實驗證實［38］,只是這些基因的表達被嚴格限制于昆蟲的一些特殊組織和發育狀態［15］。

盡管某些昆蟲、昆蟲的某些組織或某些昆蟲細胞具有潛在的產生哺乳動物的復合型末端唾液酸化的 N-糖鏈的能力,但目前在以 sf21、sf9和 BTI-Tn-5B1-4(High Five)及 Bm細胞作為宿主使用的昆蟲桿狀病毒表達系統中,表達的重組 N-糖蛋白的糖鏈是簡單的、沒有唾液酸化的低甘露糖型,而不是哺乳動物在相同糖基化位置產生的唾液酸化的復合型糖鏈。這使得昆蟲桿狀病毒表達系統實際上不可能期望能夠生產出具有高等動物的 N-糖鏈的糖蛋白,極大地限制了昆蟲桿狀病毒表達系統在表達哺乳動物糖蛋白上的應用。

4 目前關于昆蟲蛋白質 N-糖基化途徑的觀點

昆蟲桿狀病毒系統自建立以來,表達了包括糖蛋白在內的大量重組蛋白,提供了很多鱗翅目昆蟲細胞的 N-糖基化途徑的信息,也間接促進了昆蟲蛋白質的 N-糖基化途徑的生化和分子遺傳學的研究。昆蟲基因組項目的完成,尤其是果蠅基因組項目［39］和家蠶基因組項目［40］對我們理解認識昆蟲蛋白質的 N-糖基化途徑具有巨大的促進作用。

目前的觀點是,哺乳動物和昆蟲蛋白質糖基化途徑的前半部分,包括 N-糖鏈的起始轉運和核心糖鏈的剪切加工是相似或一樣的,都產生一樣的高甘露糖的核心糖鏈。這個共同的核心糖鏈,一是作為后續糖基化的中間體,隨后修飾加工成 1個或 2個共同的中間產物 GlcNAcMan3GlcNAc［±Fuc］Glc-NAc,進入哺乳動物和昆蟲不同的后半部分。二是直接作為一些糖蛋白的某些糖基化位點上寡糖鏈的最終產物。在哺乳動物和昆蟲細胞蛋白質糖基化的后半部分,N-糖鏈的中間體延伸加工過程及摻入的修飾酶均不同。哺乳動物的蛋白質 N-糖鏈延長加工成常見的雙天線復合型結構,而昆蟲細胞的蛋白質 N-糖鏈為低甘露糖結構,含有核心 α-1,3巖藻糖,有時末端 N-乙酰葡糖胺會被 GlcNAcase移除。其中產生的核心 α-1,3巖藻糖會在人體內引起過敏反應。

實際上,在昆蟲蛋白質的糖基化修飾過程中,最終的 N-糖鏈的形成有時決定于很多不同的因子。其中一個明顯的因子就是糖蛋白產物自身的自然屬性,其蛋白質本身及其糖鏈加工修飾的一系列產物是否為相應糖基修飾酶的較好底物,會影響和決定隨后的加工途徑及最終糖鏈構型。另一方面,編碼這些糖基修飾酶基因的不同表達水平及其下游調控作用,也會明顯地影響蛋白質 N-糖鏈的最終構型。

5 昆蟲蛋白質 N-糖基化途徑改造

盡管昆蟲自身具有優化 N-糖基化進程的潛能,使蛋白質修飾的糖鏈類似哺乳動物,但目前的昆蟲桿狀病毒系統還不能表達出具有哺乳動物糖鏈構型的重組糖蛋白。利用改變昆蟲細胞的培養液配方組成或改造病毒載體及昆蟲細胞株,是生產具有哺乳動物糖鏈構型糖蛋白的可以探索的新研究方向。比較有效可行的方法是利用基因改造的方法,對昆蟲桿狀病毒表達系統的宿主細胞系,進行糖基化途徑改造,引入哺乳動物的一些相關糖基修飾酶基因,人為地改變昆蟲的糖基化途徑。技術層面上,可以通過將相關糖基修飾酶利用桿狀病毒引入昆蟲宿主細胞或者直接基因改造昆蟲宿主細胞,達到改造昆蟲糖基化修飾途徑的目的,但引入的糖基化修飾基因表達的時間非常重要。這要求引入的糖基修飾酶的表達,要比所要表達的重組糖蛋白在時間上提前的多,才能保證表達的目的重組糖蛋白的糖基化按設計好的途徑進行。

目前一些文獻報道,用轉染和雙篩選方法,將編碼和表達哺乳動物的 β1,4GalT(Sfβ4GalT［41］)、α-2,6sialyltransferase(Sfβ4Gal/ST6［42］和 Tnβ4Gal/ST6［43］)、 GlcNAc-T、 GlcNAc-TII、 β-1,4 GalT、 α-2,6sialyltransferase及 α-2,3sialyltransferase(SfSWT-1［44］)基因插入昆蟲細胞sf9及 BTI-Tn-5B1-4(High Five)中得到亞細胞株。這些新細胞株的生長特性和它們的母系相似,當桿狀病毒感染該細胞亞株表達外源糖蛋白時,蛋白質上的糖鏈延長為類似哺乳動物的雙天線復合型末端單唾液酸化的糖鏈結構［44］。

通常昆蟲細胞系 (如Sf9)不具有 sialyltransferase酶活性的底物 CMP-sialic acid,這種物質是糖鏈唾液酸化所必需的［45］。但細胞亞株 SfSWT-1可以在含有外加唾液酸的培養基中,使表達的糖蛋白的糖鏈唾液酸化,表明這些昆蟲細胞具有補償型營養途徑［46］。隨后人們將編碼唾液酸合成酶和 CMP-唾液酸合成酶的哺乳動物基因,插入 SfSWT-1細胞內,得到的 SfSWT-3細胞株,就能夠在細胞內合成CMP-唾液酸,形成的糖鏈為雙天線、末端單唾液酸化的復合型 N-糖鏈［47］。

6 小結和展望

到目前為止,昆蟲桿狀病毒表達系統已經被廣泛地用來表達各種各樣的重組糖蛋白,對這些糖蛋白的研究,直接或間接地拓展了我們對昆蟲系統的N-糖基化途徑的理解。但由于昆蟲桿狀病毒表達系統,不能像哺乳動物細胞一樣產生雙天線的復合型唾液酸化的糖鏈,而使其在應用上受到限制。盡管昆蟲細胞內也部分地具有和 N-糖鏈最后修飾相關的哺乳動物同類糖鏈修飾酶的表達,但這些酶被嚴格地限制于某些昆蟲、昆蟲某些組織類型或某些不知道的環境因素所控制的某些昆蟲發育階段。另外,某些昆蟲細胞株(如 Trichoplusia ni)所表達的重組糖蛋白糖鏈具有核心 α-1,3連接的巖藻糖,在人體中會引起過敏反應。這些昆蟲非復合型唾液酸化糖鏈和具有核心 α-1,3連接的巖藻糖修飾都易引起人類過敏反應,限制了昆蟲桿狀病毒表達系統在醫藥上的應用。需要發展新的能夠替代的病毒宿主、宿主生長環境條件或轉基因的病毒宿主等系統,其具備產生哺乳動物糖鏈的能力。同時,還需要進一步將病毒宿主內不需要的 GlcNAcase及核心α-1,3連接的巖藻糖轉運酶活性去除掉。然后,所有的對該系統改進的工作,都需要利用該系統大量表達重組糖蛋白,分析其糖鏈的變化,來檢測該系統的糖基化能力。這樣經過改造的新的昆蟲桿狀表達系統,就能夠用于生產醫藥應用的糖蛋白,尤其是能夠直接用于體內治療應用的糖蛋白,更好地為人類應用。

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S881.2

B

1007-0982(2011)02-0008-06

2010-12-01;

2011-03-03

韋亞東(1969—),男,山東莒南,博士,副研究員。

Tel:0511-85616587,E-mail:yadongww@yahoo.com