凝膠層析分離提純蘆薈多糖的方法

云南萬(wàn)綠生物股份有限公司 羅秉俊 張?zhí)K云

目的：通過凝膠層析法提高蘆薈多糖的含量

基本原理：凝膠是一種不帶電荷的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、呈珠狀顆粒的物質(zhì)，每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致，像篩子，直徑大于孔徑的分子將不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，便直接沿凝膠顆粒的間隙流出，稱為全排出。較小的分子在容納它的空隙內(nèi)，自由出入，造成在柱內(nèi)保留時(shí)間長(zhǎng)。由此過程，較大的蘆薈多糖分子先被洗脫下來，而較小的分子后被洗脫下來，從而達(dá)到相互分離提純。

器材及試劑

玻璃層析柱；葡聚糖凝膠；蘆薈凝膠汁

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

干膠用量的計(jì)算

干膠用量（g）=柱床體積（ml）/凝膠的床體積（ml/g）

由于凝膠處理過程以及實(shí)驗(yàn)過程可能有一定損失，所以一般凝膠用量在計(jì)算的基礎(chǔ)上再增加10%～20%。

凝膠的處理：葡聚糖凝膠市售商品為干燥顆粒，使用前必須充分溶脹。方法是將欲使用的干凝膠緩慢地傾倒入5～10倍的去離子水中，進(jìn)行充分浸泡，然后用傾倒法除去表面懸浮的小顆粒，并減壓抽氣排除凝膠懸液中的氣泡，準(zhǔn)備裝柱。許多情況下，也可采用加熱煮沸方法進(jìn)行凝膠溶脹，此法不僅能加快溶脹速率，而且能除去凝膠中污染的細(xì)菌，同時(shí)排除氣泡。

凝膠柱的裝備：凝膠柱子裝的質(zhì)量好與差，是柱層析法能否成功分離純化物質(zhì)的關(guān)鍵步驟之一。一般要求柱子裝的要均勻，不能分層，柱子中不能有氣泡等。否則要重新裝柱。

首先選好柱子，根據(jù)層析的基質(zhì)和分離目的而定。一般柱子的直徑與長(zhǎng)度比為1∶10～50；同時(shí)將柱子洗滌干凈。然后關(guān)閉層析柱出口，裝入1/3柱高的洗脫液，將處理好的凝膠緩慢地倒入柱中，打開出水口，控制適當(dāng)流速，使凝膠均勻沉降，再加入一定量的洗脫液（控制凝膠不分層，否則必須重新裝柱）。最后用滴管吸去凝膠床面上的溶液，使洗脫液恰好流到床表面，同時(shí)關(guān)閉出水口。

加樣與洗脫：加樣要盡量快速、均勻。另外加樣量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可能造成較大的影響，加樣過多，會(huì)造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，提純后各組分量少、濃度較低，實(shí)驗(yàn)效率低。加樣量的多少要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求而定：凝膠柱較大，當(dāng)然加樣量就可以較大；樣品中各組分分子量差異較大，加樣量也可以較大；一般分級(jí)分離時(shí)加樣體積約為凝膠柱床體積的1%～5%左右，而分組分離時(shí)加樣體積可以較大，一般約為凝膠柱床體積的10%～25%。

加樣方法：如同離子交換柱層析一樣，凝膠床經(jīng)平衡后，吸去上層液體，待平衡液下降至床表面時(shí)，關(guān)閉流出口，用滴管加入樣品液，打開流出口，使樣品液緩慢滲入凝膠床內(nèi)。當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面持平時(shí)，小心加入數(shù)毫升洗脫液沖洗管壁。然后繼續(xù)用大量洗脫液洗脫。

洗脫：加完樣品后，將層析床與洗脫液儲(chǔ)瓶、檢測(cè)儀、分部收集器及記錄儀相連，根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)，預(yù)先估計(jì)好一個(gè)適宜的流速，定量地分部收集流出液，每組分一至數(shù)毫升。各組分可用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行定性或定量分析。

凝膠柱的重復(fù)使用與保存：當(dāng)樣品的各組分全部洗脫下來之后，即可加入新的樣品，繼續(xù)使用。

打開出水口，繼續(xù)用2～3倍床體積洗脫劑洗脫，洗脫后關(guān)閉出口，以備下次使用。

保存方法有三種：（1）在液相中保存最方便，即于凝膠懸液中加入防腐劑（一般為0.02%N2N3或0.002%洗必泰）或高壓滅菌后4℃保存。此方法至少可以保存半年以上。（2）用完后，以水沖洗，然后用60%～70%酒精液沖洗，凝膠體積縮小，即在半收縮狀態(tài)下保存。（3）長(zhǎng)期不用者，最好以干燥狀態(tài)保存，即水洗凈后，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽濾干，于60℃～80℃干燥后保存。

小結(jié)：通過凝膠層析法提純蘆薈多糖，有效地去除了蘆薈凝膠汁里的小分子雜質(zhì)，使蘆薈凝膠汁的多糖含量從原來的5%提高到18%，成為分離純化蘆薈大分子的一種重要手段。