紅霉素誘導呼吸道分離金黃色葡萄球菌耐藥狀況研究

王 軼,劉珊珊,黃 瑾

(中山大學附屬第五醫院1.ICU;2.呼吸科,廣東 珠海519000)

本研究以紅霉素為代表,探討金黃色葡萄球菌在不同藥物濃度下耐藥產生的比率及何濃度下更容易誘導耐藥,并探討對紅霉素高度耐藥的菌株是否有遺傳穩定性,及對其他種類的抗生素有無交叉耐藥,以期對臨床醫生用藥給予一定的指導。

1 材料與方法

1.1 受試菌株 標本為從我院臨床呼吸道標本中分離出的對紅霉素敏感(MIC≤0.5 μ g/ml)的菌株4株,來自晨起痰標本、纖維支氣管鏡吸取痰標本、支氣管肺泡灌洗液。標準菌株ATCC 29213來自衛生部臨床檢驗中心。菌株均經過革蘭氏染色及美國BD公司生產的Phoenix100全自動微生物鑒定儀通過鑒定/藥敏復合板鑒定及測定MIC值,試驗前再次采用NCCLS M-27A方案,用瓊脂稀釋法對試驗菌株進行藥敏試驗[1]。

1.2 誘導方法 含紅霉素的藥物瓊脂平皿從四分之一MIC(0.125 μ g/ml)開始,以 2倍連續稀釋濃度配制,把臨床分離的菌株與標準菌株在不同藥物濃度含藥平皿中各接種5-10代,每株菌株同時設空白對照組,于每個藥物濃度傳代后測MIC值的變化[2],以 8 μ g/ml≤MIC ≤16 μ g/ml為低度 耐藥 ,16 μ g/ml≤MIC ≤64 μ g/ml為中度耐藥 ,MIC ≥256 μ g/ml為高度耐藥。成功誘導后,再測定耐藥突變株的遺傳穩定性及對其他種類抗生素包括青霉素類、頭孢類、氨基糖甙類、喹諾酮類等有無交叉耐藥。

2 結果

4株敏感菌株及1株標準菌株在不同濃度梯度的培養皿中多次傳代后,獲得了抗不同濃度紅霉素的耐藥突變菌株。5株菌株最后的MIC值分別為2株 MIC ≥256 μ g/ml,2 株 4 μ g/ml＜MIC ＜8 μ g/ml,1株16 μ g/ml＜MIC ＜32 μ g/ml。同時做空白對照的只在空白培養皿中的5株菌株的MIC值分別為3株2 μ g/ml＜MIC ＜4 μ g/ml,1 株 1 μ g/ml＜MIC ＜2 μ g/ml,1株 0.5 μ g/ml＜MIC ＜1 μ g/ml。耐藥突變菌株經遺傳穩定性測定后發現其獲得的耐藥性是穩定的。誘導前后的菌株均未對其他種類抗生素發生交叉耐藥。

3 討論

臨床抗生素的不合理使用及濫用使得耐藥菌株不斷增加,特別是近年來革蘭氏陽性球菌感染不斷上升,約占醫院感染的40%,已經重新成為醫院感染的主要病原菌,其中金黃色葡萄球菌占所有革蘭氏陽性球菌感染的第一位[3]。

大環內酯類抗生素不良反應少、半衰期長、臨床適應證廣而仍被使用在金葡菌的社區感染和醫院感染的敏感菌株上。所有CAP指南都推薦用大環內酯單一療法治療門診或住院病人[4]。紅霉素在細胞中的作用方式有兩種[5]:一是抑制50S核糖體大亞基的形成;另一個是抑制核糖體的翻譯作用。安全性和有效性使大環內酯得到廣泛的應用,而耐藥性也相應增加。抗性細菌主要通過影響紅霉素在胞內的積累(大環內酯的外排機制)、破壞紅霉素的結構使其失去抗菌作用、改造或修飾紅霉素在核糖體上的結合作用位點來消除環境中的紅霉素抗菌作用。

以往金黃色葡萄球菌耐藥性的研究,多采用不匹配的菌株,這些菌株背景復雜多樣,其耐藥性的產生受多種因素影響,如不同來源、不同患者的用藥情況、患者的依從性等。本實驗采用人工誘導耐藥的方法,通過考查同一菌株在藥物的選擇壓力下,由敏感到耐藥的演變過程,復制金黃色葡萄球菌的耐藥模型,為其耐藥機制的研究奠定基礎,為臨床合理用藥提供可靠的理論依據。

對耐藥菌的出現,人們通常習慣認為是抗生素殺死了敏感菌,而將耐藥的菌群亞株選出來,即耐藥株是先天存在的,而非后天的適應性改變[6]。本實驗金黃色葡萄球菌在藥物選擇壓力的作用下,為了使自身適應生存環境,通過一系列的方式如改變自身基因結構去適應環境,即產生耐藥性,且根據結果可以看出高度耐藥菌株的一半在二分之一MIC時產生,從而確認所謂小劑量預防用藥是錯誤的。

在本實驗初始,敏感菌在較高含紅霉素濃度(≥0.5 μ g/ml)培養均不能生長,說明足夠濃度的抗菌藥物可有效殺滅致病菌,提示臨床上在選擇合理、足量地應用抗菌藥物才能有良好療效。實驗結果的敏感菌從低至高逐級紅霉素濃度培養,非但不能殺滅金黃色葡萄球菌,反而篩選出的高度耐藥菌生長,這說明了劑量不足、給藥方法等不合理的應用抗菌藥物是導致致病菌耐藥性出現的重要原因之一,結果嚴重影響臨床療效。

本實驗通過體外耐藥性誘導獲得的金黃色葡萄球菌耐藥株,有1株在二分之一MIC濃度時誘導耐藥,1株在2MIC時誘導耐藥,說明臨床用藥時,無論是劑量不足還是劑量過大,都有可能誘導細菌變異,特別是在劑量不足的情況下。同時,對劑量過大誘導的耐藥,因考慮到細菌單純傳代時也可引起細菌的MIC變化,故在大劑量藥物引起細菌耐藥的過程中有無此因素的參與尚不確定,臨床上尚不能完全參考此結果。

高度耐藥菌株誘導成功后,在無藥培養基中經5次傳代,其MIC值不發生改變,說明菌株的獲得性耐藥具有穩定性。此穩定性提示臨床用藥時,即使間隔一段時間再用同類藥物仍不會有明顯療效。將誘導后的耐藥株測定對非誘導藥物的MIC,并比較誘導前后MIC的比值,其他抗生素的MIC無明顯變化,說明紅霉素與其他抗生素無交叉耐藥,說明在臨床上感染嚴重時可以聯合用藥以提高療效。此與何禮賢[7]的研究結果以及2001年美國胸科學會修訂的《成人社會獲得性肺炎處理指南》中的觀點一致[8]。

在空白平皿中單獨傳代也導致敏感菌株的MIC值較前有較大的變化,說明臨床用藥過程中,細菌可能隨著細菌傳代引起耐藥,使治療效果不盡人意,提示臨床用藥時,可以隨著治療的過程延長,增加用藥的劑量以保證治療效果。

綜上所述,現革蘭陽性球菌的感染不斷增多,耐藥率逐年升高,目前治療耐藥革蘭陽性菌感染新藥雖不斷問世,然而對耐藥菌感染的控制并不能僅依賴于高效新藥,嚴格掌握適應證,根據患者病情、病原菌藥敏結果合理選用藥物,有指征預防用藥,監測細菌耐藥性、掌握耐藥機制等綜合措施的實施,才能提高耐藥菌感染的防治水平,減緩細菌耐藥性的增長。

[1]陳民鈞.美國臨床實驗室標準化委員會2004年版有關藥敏試驗標準化更新要點[J].中華檢驗醫學雜志,2004,27(9):608.

[2]臨床實驗室標準化協會.抗微生物藥物敏感試驗的執行標準;第十六版信息增刊.CLSI文件 M100-S16(ISBN 1-56238-556-7).2006,26(3):37-41.

[3]倪語星.葡萄球菌研究進展[J].中國處方藥,2005,44(11):18.

[4]中華醫學會呼吸病學分會.社區獲得性肺炎診斷和治療指南[J].中華結核和呼吸雜志,2006,29(10):651.

[5]Matsuoka M,Inoue M,Nakajima Y,et al.New erm Gene in Staphylococcus aureus clinical isolates[J].Antimicrob Agents Chemother,2002,46(1):211.

[6]Cairns J,Overbaugh J,Meller S.The origin of mutants[J].Nature,1988,335(6186):142.

[7]何禮賢.社區獲得性肺炎診治指南評價及有關問題[J].中國抗感染雜志,2004,27(4):28.

[8]Niederman MS,Mandell LA,Anzueto A,et al.Guidelines for the management of adults with community-acquired pneumonia.Diagnosis,assessment of severity,antimicrobial therapy,and prevention[J].Am J Respir Crit Care Med,200l,163:1730.