用豬小腸細胞外基質膜(ECM）修復家兔缺損胸壁的實驗研究

吳金鳳,薛錦儒,崔建華*

(1.長春大學醫院,吉林 長春 130022;2.吉林大學中日聯誼醫院 胸外科,吉林長春 130033）

天然的細胞外基質膜(ECM）亦稱脫細胞基質膜或組織支架,主要取自動物的小腸或膀胱,是一種去除細胞成分的基質膜,主要由Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ型膠原和絲蛋白構成。用ECM修復因傷病所致的組織缺損,不僅能恢復其解剖形態還能隨著宿主組織器官的生長而生長,從而恢復或部分恢復所修復器官的生理功能,因此ECM組織支架的應用正在為外科學的發展提供一個全新的理念和更廣闊的拓展空間。

胸壁腫瘤、外傷所造成的胸壁部分缺失、肺癌或乳腺癌侵及胸壁,乳癌術后過度放療等原因造成胸壁缺損的情況,在臨床上并非少見[1]。傳統的方法多以人工材料修復或以轉移皮瓣、帶血管蒂的游離肌皮瓣修復。然而,前者修復范圍有限,后者又以犧牲一部分健康組織為前提,有“拆東墻補西墻”之虞。用組織工程的方法制成ECM膜片修復胸壁缺損,是近年來國外研究的新熱點,在以往的研究中多主張用“三明治方法”雙層修復,但由于不同的胸壁組織所承擔的生理功能不同,細胞生長與組織愈合周期也不同,因此對不同的胸壁組織如胸膜、肌肉組織、骨組織等分別加以修復似乎更為合理,我們用家兔為動物模型對此進行了研究。

1 材料與方法

1.1 豬小腸ECM的制取、滅菌與保存

體重30-40 kg的地產雜種豬6頭,全麻下氣管插管機械通氣,按無菌手術的要求剃毛備皮。正中開腹切取屈氏韌帶遠側小腸100 cm,以生理鹽水沖洗腸內容,按10 cm長度將小腸分割成10段,浸于4℃生理鹽水中。每段小腸從側方剖開,在特制的裝置固定下,以自制的刮除器仔細剔除小腸粘膜與漿肌層,取出ECM。將4層ECM擠壓成膜片并經真空凍干24小時,裝入密封的塑料袋中。經直線加速以8000拉德放射劑量照射滅菌后,常溫下保存。

1.2 用豬小腸ECM膜片修復兔的缺損胸壁

新西蘭白兔12只,雌雄兼用,體重5-8 kg,分為2組。肌注開他敏(1 mg/kg）誘導麻醉,氣管插管吸入乙氟醚維持麻醉。動物剔毛,胸部皮膚消毒鋪無菌巾。在右胸中部包括5-7肋骨,分層依次切除皮膚、皮下組織、胸肌、肋骨、胸膜進入胸腔,電凝止血,造成胸壁直徑3.5 cm缺損。實驗組:剪取3.5×3.5 ECM膜片,從內到外依次分3層分別修復胸膜和肋間肌及肋骨、胸肌、皮下組織與皮膚,其中肋骨的修復是先將ECM縫成管狀,從兩端將肋骨套入,再敷以生物膠,縫線選用6-0 Proline線。對照組:剪取3.5×3.5 ECM 膜片,用雙層“三明治法”縫合,內層襯于胸膜,外層覆于皮膚,以6-0 Proline線均勻縫合8針,最后一針結扎前經氣管插管吹肺,使右肺充分膨脹,兩組均未放置胸腔引流管。術后經靜脈給予頭孢氨芐(35 mg/kg）一次/日,持續7天。術后60天將動物處死,切取胸壁修復處標本,運用形態學、組織學和生物力學等方法對標本進行觀察。實驗組和對照組分別在胸壁缺損修復處切取組織標本。組織學標本以40%甲醛固定,石蠟包埋,制成3 μ m石蠟切片,常規HE染色,光學顯微鏡下進行組織學觀察。由于新生的胸膜與肋間肌以及新生的肋骨已經成為一體,難以分離解剖,因此兩組靜態單軸力學測試標本分別取自再生胸壁的內層和外層,游標卡尺測量其厚度(0.5±0.1）mm,將其浸泡于25℃緩沖液中固定在Instron5848力學實驗系統上,夾持間距8 mm,以5mm/min速度拉伸,再通過曲線計算最大負荷和最大應力。

統計學處理;檢測數據采用均數±標準差表示,組間比較分別行t檢驗和 χ2檢驗,以P＜0.05有統計學意義。采用SPSS10.0統計軟件分析。

2 結果

24只實驗動物全部存活到術后60天,無明顯感染,飲食體重均正常。

2.1 大體觀察兩組動物胸壁缺損處ECM補片已無法辨認,組織生長平展、均呈瘢痕樣愈合,無毛發生長,未見反常呼吸運動。實驗組缺損修復處胸壁明顯比對照組厚,前者為4.31±0.14 mm;后者為3.58±0.11 mm(P＜0.05）。

2.2 組織學觀察實驗組與對照組鏡下均難以區分不同組織結構,纖維密度均勻,排列規則,與周圍組織分界不清,靠近邊緣處肌纖維增多,并見到較多的鱗狀上皮細胞和炎癥細胞浸潤。在實驗組切片鏡下見到條狀和橋狀鈣化,均出現在橫切面的中央,相當于肋骨的深度,而對照組均未見鈣化現象。

2.3 生物力學觀察由于肉眼難以區分不同組織結構,兩組間生物力學測試標本分別取自相當于胸膜和肋間肌及肋骨床的內層;相當于胸肌和皮膚的外層。內層測試最大負荷:實驗組為8.46±1.01(N）;對照組為6.49±0.47(N）(P＜0.05）;外層測試最大負荷:實驗組為5.32±0.76(N）;對照組為5.07±0.85(N）(P＞0.05）。內層測試最大應力:實驗組為3.22±0.11(MPa）;對照組為2.13±0.27(MPa）(P＜0.05）;外層測試最大應力:實驗組為3.32±0.76(N）;對照組為3.07±0.85(N）(P＞0.05）。

3 討論

外科治療胸壁缺損,傳統上都是用自身正常組織進行修復,或是用人工合成的高分子材料修復。隨著組織工程技術的發展,這種以犧牲部分健康組織為代價的“以傷療傷”的理念正在被改變;而以人工合成材料修復病損的方法也存在一系列的缺陷,尤其是合成材料不能隨宿主組織器官的生長而相應增長,因此限制了它們在年幼病人體內的應用,或是在年幼病人成長過程中需再次乃至多次更換人工合成材料。ECM是一種良好的組織工程材料,來源于異種動物的ECM具有取材廣泛,滅菌后可長期保存,可進行商品化生產等特點,可應用于外科創傷、燒傷、整形、器官修復等多個領域,由于去除了細胞成分,ECM不具有抗原性[2-4]。我們用豬的小腸制取ECM,因為(1）從分子生物學的角度來看,豬的基因組與人類相近;(2）豬的來源豐富;(3）豬的生長過程可人為控制,取自不同體重和不同成熟狀態豬的小腸ECM可用于不同年齡段和不同體重的病人。

從本實驗的結果可以看出,ECM植入體內后起到組織支架的作用[5-6],其周圍的相鄰組織細胞可以沿組織支架移行和生長,最終將胸壁的缺損完全修復。然而不同的組織細胞生長速度不同,肌肉組織和皮膚生長速度似乎較骨組織和胸膜組織生長更快些,因此鏡下見到較多的橫紋肌細胞和皮膚再生的鱗狀細胞,代表胸膜再生的間皮細胞未見到,而代表肋骨再生的鏡下所見僅在實驗組見到條狀和橋狀鈣化。其次,不同的外科修復方式也影響修復的結果,本實驗中,實驗組將胸壁不同的組織分別加以修復,結果胸壁缺損處明顯厚于對照組(P＜0.05）,生物力學測試結果也表明,分別加以修復者,其胸壁內層負荷-應變力優于對照組,說明用此種方法修復缺損的胸壁,對胸壁順應性的影響小。胸壁的構建不僅需要封閉創口,還需要構建骨性胸廓,后者對于維持正常的胸壁順應性和呼吸功能具有重要意義。實驗組切片上見到的鈣化,說明在ECM的誘導下,肋骨的再生是可以實現的。因此本實驗可以得出這樣的結論:不同的胸壁組織分別用ECM加以修復,明顯優于內外兩層“三明治”式的修復方法。尚需說明,無論采取何種修復方式對毛囊再生均無影響,因為兩組在缺損修復處均未見到新生的毛發。

國內外用ECM修復胸壁缺損仍處于臨床前研究階段,要真正用于臨床還有許多問題需要解決,譬如:在修復胸壁的過程中需要多長時間ECM可吸收殆盡?ECM最大可修復的范圍占胸壁的百分比是多少?胸壁兩種不同修復方式對呼吸功能的影響有何不同?對這些需要在今后的研究中進一步加以證明。

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