棉籽粕多菌種固體發酵條件的響應面優化研究

葛洪 張占軍 房詩宏 張媛媛

棉籽粕是棉籽提取棉籽油后的副產品，粗蛋白質含量可高達53%，僅次于豆粕，是重要的植物性蛋白質資源之一[1]。棉籽粕是廣泛應用于飼料工業的蛋白源。但由于棉籽粕中含有游離棉酚等抗營養因子、氨基酸比例不均衡、棉籽結構致密造成的適口性差和消化率偏低等因素限制了其應用[2]。目前，應用發酵技術處理棉籽粕，是有效提高棉籽粕品質的方法之一。在發酵過程中還可以產生直接被動物吸收的小肽和其他多種生物活性物質，這對動物的生長十分有利。同時，在發酵過程中會產生呈味物質，這對于幼齡動物，具有明顯的誘食效果。此外，由于部分碳水化合物被降解，棉籽粕致密結構變得疏松，適口性將顯著提高。

響應面優化法是20世紀90年代初從西方興起的一種試驗統計方法,它包括了試驗設計、建模、檢驗模型的有效性、篩選最佳組合條件等眾多試驗和統計技術,通過對方程的回歸擬合和響應曲面、等高線的繪制，可方便地求出相應于各因素水平的響應值[3-4]。應用響應面法對工藝條件進行設計和優化,可獲得最佳工藝，了解生產過程中各因素的影響和交互作用,為試驗的改進和生產工藝標準的制訂提供可靠的數據[5]。

本研究利用熱帶假絲酵母、紅曲霉和枯草芽孢桿菌對棉籽粕進行混合菌固體發酵，以棉籽粕中游離棉酚為評價指標，在發酵時間、接種量、發酵溫度等單因素試驗基礎上，利用響應面分析法優化棉籽粕多菌種固體發酵的工藝條件，旨在為進一步開發和利用棉籽粕資源及工業化發酵生產提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 棉籽粕

由德州中鈿生物科技有限公司提供，粗蛋白含量49.90%，游離棉酚含量842 mg/kg(數據由本實驗室按照飼料中粗蛋白測定方法GB/T 6432—94及飼料中游離棉酚測定方法GB13086—91測定)；麩皮為市售。

1.1.2 菌種

紅曲霉由本實驗室從紅曲米中自主篩選得到；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)及熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)購于中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 培養基

1.1.3.1 斜面培養基

LB培養基:牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂15～20 g、水1 000 ml，pH值7.0～7.2。

YPD培養基：酵母膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g，加水1 000 ml。

1.1.3.2 液體種子培養基(LB液體培養基)

牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、水1 000 ml，pH值7.0～7.2。

1.1.3 .3三角瓶棉籽粕發酵培養基

棉籽粕44%、麩皮10%、尿素2%、水分44%（即按料液比1∶1，g/ml），裝量50 g/250 ml，封口，121℃滅菌15 min。

1.1.4 主要儀器和設備

島津UV-260型分光光度計（日本島津有限公司）、恒溫搖床（伊孚森INFORS生物技術有限公司）；恒溫培養箱（德國MEMMERT進口培養箱）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；凱氏定氮儀（KDY-9820，北京市通潤源機電技術有限公司）；控溫型遠紅外消煮爐（四平電子研究所）；分析天平（上海恒平科學儀器有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；3-氨基-1-丙醇[阿拉丁試劑有限公司（進口分裝）]，其他試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 液體種子制備

將活化好的紅曲霉菌種從斜面培養基接種到裝有100 ml豆芽汁種子培養基的250 ml三角瓶中，在恒溫搖床中30℃培養5 d后轉移到冰箱中備用；將活化好的枯草芽孢桿菌菌種從斜面培養基接種到裝有100 ml LB液體種子培養基的250 ml三角瓶中，恒溫搖床中30℃培養18 h后轉移到冰箱中備用；將活化好的熱帶假絲酵母從斜面培養基接種到裝有100 ml豆芽汁種子培養基的250 ml三角瓶中，在恒溫搖床中30℃培養20 h后轉移到冰箱中備用。

1.2.2 測定項目與方法

飼料中粗蛋白測定方法采用GB/T 6432—94；飼料中游離棉酚測定采用GB13086—91。1.2.3混菌三角瓶發酵單因素試驗

采用紅曲霉、枯草芽孢桿菌及熱帶假絲酵母比例為1∶1∶1的混合菌種進行三角瓶棉籽粕發酵試驗，分別采用不同的接種量、不同的發酵溫度、不同的發酵時間進行單因素試驗。發酵產品60℃下烘干后，測定發酵產品中的粗蛋白及游離棉酚含量。

1.2.4 混菌三角瓶發酵優化試驗

采用Design Expert 7.0.0軟件對影響發酵去除游離棉酚的幾個因素的參數作響應面優化，以便改進棉籽粕固體發酵工藝。

2 結果與分析

2.1 單因素對棉籽粕發酵脫除棉酚的影響

2.1.1 接種量對棉籽粕發酵脫除棉酚的影響

在采用紅曲霉、枯草芽孢桿菌及熱帶假絲酵母比例為1∶1∶1的混合菌種進行三角瓶棉籽粕發酵試驗時，固定發酵溫度30℃，發酵時間72 h的條件下，分別按5%、10%、15%、20%和25%的接種量接種至三角瓶進行棉籽粕固體發酵并測定其游離棉酚的含量，結果見圖1。

圖1 接種量對棉籽粕發酵脫除棉酚的影響

由圖1可見，在接種量較低時，菌種濃度過低致使發酵不完全，導致游離棉酚含量較高。當接種量增大到10%時，游離棉酚下降最多，此時游離棉酚只有(126.26±16.73)mg/kg。此后隨著接種量的增大，游離棉酚并未呈顯著的下降，當接種量達25%時，游離棉酚含量反而增加，可能是由于濕度過大，影響了發酵的進行。因此，在優化試驗中，選擇10%接種量為優化中心點。

2.1.2 發酵溫度對棉籽粕發酵脫除棉酚的影響

在采用紅曲霉、枯草芽孢桿菌及熱帶假絲酵母比例為1∶1∶1的混合菌種進行三角瓶棉籽粕發酵試驗時，改變發酵溫度，而固定發酵時間72 h和采用10%的接種量的條件下，接種至三角瓶進行棉籽粕混合菌種固體發酵并測定游離棉酚的含量，結果見圖2。

圖2 發酵溫度對棉籽粕發酵脫除棉酚的影響

從圖2可以看出，隨著發酵溫度的升高，棉籽粕中游離棉酚逐漸減少，至30℃時游離棉酚最低，此后溫度升高，游離棉酚含量不再減少反而有所升高。綜合能耗情況，選擇30℃為溫度優化中心點。

2.1.3 發酵時間對棉籽粕發酵脫除棉酚的影響

在采用紅曲霉、枯草芽孢桿菌及熱帶假絲酵母比例為1∶1∶1的混合菌種進行三角瓶棉籽粕發酵試驗時，固定發酵溫度30℃和采用10%的接種量的條件下，觀察不同發酵時間后發酵底物中游離棉酚的含量，結果見圖3。

圖3 發酵時間對棉籽粕發酵脫除棉酚的影響

由圖3可以看出，隨著發酵時間的延長，發酵進行的越徹底，游離棉酚含量下降的越明顯，但方差分析表明，發酵時間為72 h和84 h游離棉酚下降差異并不顯著，考慮到成本因素，選取72 h為發酵時間優化中心點。

2.2 響應面試驗優化

2.2.1 試驗設計與結果

響應面法以最經濟的方式、較少的試驗次數和較短的時間對所選的試驗參數進行全面研究[6]。根據單因素試驗結果，選取接種量(X1)、發酵溫度(X2)和發酵時間(X3)3個因素作為響應變量，以游離棉酚含量為響應值，利用Design-Expert 7.0.0 Trial軟件按照Box-Behnken原理[7]進行響應面設計，優化棉籽粕固體發酵工藝，以1、0、-1分別代表自變量的3個水平，試驗因素及水平編碼如表1所示。

表1 Box-Behnken響應面試驗設計因素和水平

具體試驗設計方案及結果見表2，設計了17個試驗點的響應面分析試驗，其中12個析因點，零點試驗進行了5次以估計誤差。

表2 Box-Behnken設計模型及試驗值

2.2.2 多菌種固體發酵工藝回歸模型的建立及方差分析

利用Design-Expert 7.0.0軟件對表2中的試驗數據進行回歸分析，得到游離棉酚含量對以上3個因素的回歸方程為：

游離棉酚含量=121.32-76.68X1-86.48X2-63.56X3-50.32X1X2-33.78X1X3+4.48X2X3+111.00+191.40+64.85，對回歸模型進行方差分析，結果見表3。

由表3可以看出:模型F值為157.10，P＜0.000 1，表明模型是高度顯著的[8]；模型的失擬項P=0.060 4＞0.05，表明失擬不顯著，即該模型是穩定的[9]，能較好地預測實際發酵后游離棉酚的下降情況。模型一次項X1、X2及X3均極顯著，且顯著順序是X2(發酵溫度)＞X1(接種量)＞X3(發酵時間)；二次項均極顯著，交互項除X2X3外均極顯著，表明各具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。

表3 回歸模型方差分析

2.2.3 響應面分析及優化

通過Design-Expert 7.0.0軟件進行各因素間交互作用對游離棉酚值的響應面分析。利用軟件做出中心組合設計試驗所得的響應面曲面圖(見圖4～圖6)。響應面圖形是特定的響應值Y對應的因素X1、X2、X3構成的一個三維空間在二維平面上的等高圖，可以直觀地反映各因素的交互作用以及對響應值的影響[10]。從響應面分析圖4～圖6中可以看出響應值與影響因素的關系。等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[11]。比較3組等高線圖可直觀地看出：X1X2、X1X3之間的交互作用顯著,等高線呈橢圓形，而X2X3等高線呈圓形，說明其交互作用不顯著，這與方差分析結果一致。從響應面圖可以看出此試驗模型都能夠達到極值點，且穩定點是最小值，即為發酵后游離棉酚含量最少的點。

圖5 接種量(X1)和發酵時間(X3)交互作用的等高線和響應面圖

圖6 發酵溫度(X2)和發酵時間(X3)交互作用的等高線和響應面圖

為進一步確定使游離棉酚含量最少的最佳點，通過Design-Expert軟件，設置游離棉酚含量最小值為目標，優化最終發酵工藝條件X1為0.65、X2為0.20、X3為0.34，此條件下游離棉酚含量最低為81.04 mg/kg。根據變量賦值公式χ=(Xi-X0)/ΔX可求得最終棉籽粕固體發酵工藝條件為：接種量13.25%、發酵溫度31℃、發酵時間76.08 h。

2.2.4 模型的驗證

為了檢驗模型預測的準確性，在上述優化條件下共重復4次平行驗證試驗，同時考慮到實際操作方便，此工藝條件進一步簡化為接種量13%、發酵溫度31℃、發酵時間76 h。以此條件進行多菌種固體發酵后測定游離棉酚的含量，測得此條件下實際游離棉酚含量為(82.03±3.14)mg/kg，與模型預測值78.89 mg/kg相比無明顯差異，證明了方程的可靠性和響應面分析方法的有效性。

3 結論

采用試驗設計軟件Design-Expert 7.0.0，通過Box-Behnken中心組合試驗設計得到了多菌種固體發酵棉籽粕與接種量、發酵溫度和發酵時間關系的回歸模型,經驗證該模型是合理可靠的,能夠較好地預測經發酵后棉籽粕中游離棉酚的降低量。同時利用模型的響應面及等高線，對影響游離棉酚下降的關鍵因素及其相互作用進行了探討,得到的棉籽粕固體發酵工藝條件為：接種量13%、發酵溫度31℃、發酵時間76 h。進一步試驗證明，采用響應面分析法對棉籽粕多菌種固體發酵工藝進行優化是非常有效的。該研究結果為棉籽粕的固體發酵工藝開發提供了一定的理論基礎和參考價值。

[1] 葉明強,王紅梅,鄺哲師,等.固體發酵棉籽粕菌種組合的篩選[J].中國飼料,2009(15):8-14.

[2] 張文舉,許梓榮,孫建義,等.假絲酵母ZD-3與黑曲霉ZD-8復合固體發酵對棉籽餅脫毒及營養價值的影響研究[J].中國糧油學報,2006(6):129-134.

[3] Lee W,Yusof S,Hamid N,et al.Optimizing conditions for hot water extraction of banana juice using response surface methodology(RSM)[J].Journal of Food Engineering,2006,75(4):473-479.

[4] Sun Y,Liu J,Kennedy J F.Application of response surface methodologyforoptimizationofpolysaccharidesproduction parameters from the roots of Codonopsis pilosula by a central composite design[J].Carbohydrate Polymers,2010,80(3):949-953.

[5] 王永貴,郭俊英,張曉露,等.響應面優化法研究蔗糖苯酚樹脂膠粘劑的合成[J].化工新型材料,2011(1):113-116.

[6] 李炳輝,陳玲,李曉璽,等.超聲強化響應面法優化知母多糖的提取工藝[J].現代食品科技,2011(4):432-436.

[7] Box G E P,Behnken D W.Some new three level designs for the study of quantitative variables[J].Technometrics,1960,2:455-475.

[8] 宋燕,羅松明,向建軍,等.響應面法優化花椒籽不可溶性膳食纖維提取工藝研究[J].中國油脂,2011(7):62-67.

[9] 任天寶,馬孝琴,徐桂轉,等.響應面法優化玉米秸稈蒸汽爆破預處理條件[J].農業工程學報,2011(9):282-286.

[10] 申小麗,熱那汗·買買提,范少麗,等.響應面法玉米蛋白粉純化條件優化[J].食品工業,2011(8):7-10.

[11] 張峰,仇農學.響應面法優化超聲波輔助提取辣椒籽油及脂肪酸組成分析[J].中國油脂,2008(11):38-43.