沙蔥多糖除蛋白方法的研究

段偉偉 張興夫 敖長金

沙蔥（Allium mongolicum Regel）屬被子植物門（Angiospermae），百合科（Liliaceae），蔥屬（Allium），學(xué)名蒙古韭，蒙古語稱為“特那”，是一種生命力頑強的植物[1]。沙蔥主要分布于新疆、青海、甘肅、寧夏、陜西、內(nèi)蒙古、遼寧、蒙古西南部等地的荒漠草原和沙地[2]，其特點是抗寒、抗旱，適應(yīng)能力強。多糖是一類天然高分子化合物，它由10個以上乃至幾千個單糖以糖苷鍵相連形成的線型或支鏈的高聚物，一般多糖常由100個以上甚至幾千個單糖基組成[3]。近幾十年來，由于分子生物學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認識到了多糖及其復(fù)合物分子具有極其重要的生物功能，它在免疫功能的調(diào)節(jié)、細胞與細胞的識別和細胞間物質(zhì)的運輸?shù)确矫娑及l(fā)揮著巨大的作用[4-7]。由于沙蔥多糖溶液中含有大量的蛋白質(zhì)，這會對沙蔥多糖的進一步分離和純化造成影響，所以試驗研究了Sevage法和三氯乙酸法去除沙蔥多糖溶液中蛋白質(zhì)的最佳工藝參數(shù)，并對這兩種方法進行了比較，為沙蔥多糖的進一步分離純化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

沙蔥采自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市鄂托克旗天然草場；無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、濃硫酸、三氯乙酸、苯酚，均為分析純，購于北京化工廠；牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250購于呼和浩特市博奧試劑公司。

Sartorious BP221S電子天平；Unic2100可見分光光度計；SK-1型快速混勻器；低速大容量多管離心機。

1.2 試驗方法

1.2.1 沙蔥多糖提取

將烘干后沙蔥用98%的工業(yè)酒精按1∶8的比例（烘干沙蔥∶酒精）70℃脫脂1次，65℃烘干后按25∶1的水料比，80℃浸提8 h，抽濾棄去殘渣后的多糖提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到原體積的1/3，加等體積無水乙醇于4℃過夜，6 000 r/min離心30 min得沙蔥粗多糖，冷凍干燥后稱重，用蒸餾水配置成10 mg/ml沙蔥粗多糖溶液待用。

1.2.2 多糖含量的測定

采用硫酸-苯酚法[8]。

葡萄糖標準溶液的配制：準確稱取105℃下干燥至恒重的標準葡萄糖0.395 g于250 ml容量瓶中，加水至刻度，配得濃度為1.58 mg/ml葡萄糖母液，用移液管移取10 ml葡萄糖母液至100 ml容量瓶中定容至刻度，即得濃度為0.158 mg/ml的標準葡萄糖溶液。

苯酚溶液的配制:稱取苯酚100.000 g，加0.1 g鋁片和0.05 g NaHCO3進行常壓蒸餾，收集（180±20）℃的餾分。精密稱取該餾分6.000 g充分溶解于94.000 g去離子水中，轉(zhuǎn)置于棕色試劑瓶中，即得6%苯酚溶液，將其置于冰箱中備用。

標準曲線的繪制:分別吸取0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 ml，各以去離子水補至1.5 ml。之后加入6%苯酚溶液2.0 ml及濃硫酸6.5 ml，靜置10 min，搖勻，置于40℃恒溫水浴鍋中30 min，取出后冷卻10 min后于490 nm測定溶液吸光值，以1.5 ml蒸餾水按照同樣顯色操作為空白，橫坐標為多糖溶液的濃度，縱坐標為光密度值得到標準曲線。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍法[9]。

牛血清蛋白標準溶液的配置：準確稱取100 mg牛血清蛋白，溶于100 ml蒸餾水中，配置為1 mg/ml的原液。

考馬斯亮藍G-250的配置：稱取100 mg考馬斯亮藍G-250，溶于50 ml、90%的乙醇當中，加入85%的H3PO4100 ml,最后用蒸餾水定容到1 000 ml。

蛋白標準曲線的繪制：分別吸取牛血清蛋白原液20、40、60、80、100 μl，各以去離子水補置1 ml。分別加入5 ml配置好的考馬斯亮藍G-250。搖勻后靜置2 min在595 nm下比色，記錄下OD值。

1.2.4 Sevage法除多糖溶液中蛋白質(zhì)的正交試驗

采用3因素3水平正交試驗設(shè)計，選擇試劑添加量（A）、氯仿與正丁醇比（B）、振搖時間（C）3個因素。優(yōu)化Sevage法除沙蔥多糖溶液中蛋白質(zhì)的工藝參數(shù)。正交試驗的因素水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗的因素水平設(shè)計

1.2.5 三氯乙酸法除多糖溶液中蛋白質(zhì)的正交試驗

高濃度的三氯乙酸會造成多糖溶液的大量損失，一般用于除蛋白的三氯乙酸濃度都在5%～30%，考慮到沙蔥多糖的提取率不是很高，試驗把三氯乙酸的用量范圍設(shè)定在5%～15%，通過正交試驗研究三氯乙酸除沙蔥多糖溶液中蛋白質(zhì)的最佳工藝參數(shù)。采用3因素3水平正交試驗設(shè)計，選擇三氯乙酸的濃度（A）、三氯乙酸添加量（B）、振搖時間（C）3個因素。正交試驗因素水平見表2。

表2 正交試驗的因素水平設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量測定

標準曲線如圖1所示:葡萄糖標準曲線線性回歸方程為：y=8.834 2x-0.061 5，R2=0.999 8。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 蛋白質(zhì)含量測定

蛋白曲線的線性回歸方程為：y=0.007x-0.047，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。標準曲線如圖2所示。

Sevage法除蛋白正交試驗以除蛋白率（K）和多糖損失率(T)為評價指標，試驗的目的是找出除蛋白率最大而多糖損失率最小的工藝參數(shù)組合，綜合考慮這兩個因素，保證在多糖損失率最小的條件下除蛋白率最大。

圖2 蛋白質(zhì)標準曲線

2.3 Sevage法除多糖溶液中蛋白質(zhì)的正交試驗結(jié)果（見表3）

表3 Sevage法除蛋白正交試驗結(jié)果

由表3的極差分析結(jié)果可知：影響Sevage法除沙蔥多糖溶液中蛋白效果的主次因素為B(氯仿與正丁醇的比例)＞C(振搖時間)＞A(試劑添加量)，最佳的工藝組合條件為A2B2C2，即Sevage試劑添加量為沙蔥多糖溶液體積的1/4，氯仿與正丁醇的比例為3∶1，振搖時間為25 min。影響多糖損失率的因素的主次程度為C(振搖時間)＞A(試劑添加量)＞B(氯仿與正丁醇比例)，多糖損失率最小的工藝組合為A2B2C3，即Sevage試劑添加量為沙蔥多糖溶液體積的1/4，氯仿正丁醇的比例為3∶1，振搖時間為30 min。此時沙蔥多糖的除蛋白率為43.82%，多糖損失率為4.67%。綜合考慮除蛋白率和多糖損失率兩個因素試驗最后選用的工藝參數(shù)為A2B2C3。

2.4 三氯乙酸法除多糖溶液中蛋白質(zhì)的正交試驗結(jié)果（見表4）

表4 三氯乙酸法除蛋白正交試驗結(jié)果

三氯乙酸法除沙蔥多糖溶液中蛋白正交試驗同樣以除蛋白率（K）和多糖損失率(T)為評價指標。由正交表可以看出，影響三氯乙酸除蛋白的因素的主次程度為B(三氯乙酸添加量)＞A（三氯乙酸濃度）＞C(振搖時間)。三氯乙酸法除蛋白的最佳工藝組合為A3B1C3，即三氯乙酸的濃度為15%，添加量是沙蔥多糖溶液體積的1倍即1∶1添加，振搖時間為20 min。此時的除蛋白率為87.33%，多糖損失率為55.59%。以多糖損失率為評價指標時，影響多糖損失率的因素的主次因素為B(三氯乙酸添加量)＞A(三氯乙酸的濃度)=C(振搖時間)，多糖損失率最小的工藝組合為A3B3C2，此時多糖損失率為21.45%。通過正交試驗結(jié)果可知三氯乙酸除沙蔥多糖溶液中蛋白時對沙蔥多糖會造成很大損失。

3 討論

要對沙蔥多糖的組成、結(jié)構(gòu)、功能進行測定分析，必須將沙蔥多糖純化。沙蔥粗多糖中含有大量的結(jié)合蛋白和游離蛋白影響沙蔥多糖的分離和提純，所以在分離提純前應(yīng)該先去除溶液中的蛋白。Sevage法和三氯乙酸法都是除蛋白的有效方法，本試驗結(jié)果表明兩種方法各有優(yōu)劣，Sevage法除蛋白率低但是多糖損失少，三氯乙酸法除蛋白率高但是多糖損失量大。方升平等（2009）[10]研究發(fā)現(xiàn)，Sevage法川芎對多糖溶液中蛋白質(zhì)去除率高達90%以上，但多糖回收率僅為40%。三氯乙酸法對川芎多糖溶液中蛋白質(zhì)去除率為37.28%，多糖回收率為73.19%。徐敏等（2007）[11]研究發(fā)現(xiàn)，Sevage法除蛋白操作復(fù)雜，多糖損失量大。三氯乙酸法除蛋白去除率高并且多糖損失量少。以上研究結(jié)果與本試驗結(jié)果并不一致，分析原因可能是不同植物多糖溶液中結(jié)合蛋白和游離蛋白的含量相差很大。

4 結(jié)論

使用Sevage法去除沙蔥多糖溶液中蛋白質(zhì)的最佳工藝為：Sevage試劑添加量為沙蔥多糖溶液體積的1/4，氯仿與正丁醇的比例為3∶1，振搖時間為30 min。在此條件下，沙蔥多糖的除蛋白率為43.82%，多糖損失率為4.67%。

使用三氯乙酸法去除沙蔥多糖溶液中蛋白質(zhì)的最佳工藝為：三氯乙酸濃度為15%，與沙蔥多糖溶液按體積比1∶1添加，振搖時間為20 min。此時的除蛋白率為87.33%，多糖損失率為55.59%。

[1] 中國植物志編輯委員會.中國植物志（14卷）[M].北京:科學(xué)出版社,1980：170-172.

[2] 包穎.內(nèi)蒙古蔥屬植物的地理分布[J].內(nèi)蒙古師大學(xué)報自然科學(xué)（漢文）版，2000,29(6)：130-135.

[3] 唐杰.植物多糖生物活性功能的研究進展[J].食品研究與開發(fā)，2006,27(5):130-132.

[4] 孫成文,鐘國贛,江巖,等.黃芪多糖抗氧化損傷作用的研究[J].中國藥理學(xué)通報,1996,12(2):161-163.

[5] 周婭，佟書娟,王寧萍,等.枸杞多糖對小鼠巨噬細胞內(nèi)酶活性及NO誘生的影響[J].山東中醫(yī)雜志，2000，19(6):361-363.

[6] 龐戰(zhàn)軍,陳媛,周玫.腹腔注射云芝多糖對小鼠腹腔巨噬細胞一氧化氮產(chǎn)生的影響[J].中國動脈硬化雜志，1999，2:54-57.

[7] 清水岑夫.探討茶葉降血糖作用以從茶葉中制取糖尿病的藥物[J].國外農(nóng)學(xué)-茶葉，1990(3):38-40.

[8] 靳丹虹，紀耀華，崔玉輝，等.仙人掌莖粗多糖提取與總糖含量測定[J].時珍國醫(yī)國藥,2000,11(3):199-200.

[9] 王多寧,趙雁武,田芙蓉.考馬斯亮藍微盤比色法測定蛋白質(zhì)含量[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2001,22(6):528-529.

[10] 方升平,等.川芎多糖除蛋白方法研究.時珍國醫(yī)國藥[J].2009,20(9):2176-2177.

[11] 徐敏,裴文武，等.江蘺多糖除蛋白方的方法研究[J].食品科技,2007(9):118-120.