棉粕發酵前后營養成分變化研究

金紅春 蘭時樂 胡毅 毛小偉 肖調義

隨著水產飼料業的高速發展，魚粉資源的不斷枯竭，加上近年來國內外陸生養殖動物流行病害嚴重，動物蛋白源如肉骨粉、禽肉粉、血漿制品等的使用受到嚴重限制[1-4]。棉粕是我國除豆粕之外常用的替代魚粉的植物蛋白源，因此棉粕的開發利用是解決我國蛋白質資源短缺的主要途徑之一。作者在前人研究基礎上采用由枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium butyricum)及酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等組成的復合菌固體發酵棉粕，生產棉粕蛋白飼料，通過單因素試驗和正交優化試驗，確定其最佳發酵工藝，試圖找到一種不僅能避免化學添加劑和物理法對棉籽蛋白質功能性質的影響，還會改善適口性，提高蛋白質含量，既安全又可降低成本，具有很好發展潛力的一種有效方法，為棉粕發酵的工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 發酵菌種

發酵菌種由湖南農業大學生科院實驗室提供，粉末狀固體，活菌數＞1010CFU/g。

1.1.2 發酵原材料

棉粕、麥麩由湖南湘北水產飼料有限公司提供，棉粕粗蛋白41.25%、淀粉酶活力580 U/g、脂肪酶活力260 U/g；麥麩粗蛋白16.46%,淀粉酶活力180 U/g、脂肪酶活力150 U/g。。

1.1.3 培養基

斜面培養基：牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%、瓊脂1.5%～2.0%，pH值7.0～7.2，121℃滅菌25 min。

液體種子培養基[6]：牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%、葡萄糖5%、pH值7.0～7.2，121℃滅菌25 min。

發酵培養基：棉粕、麥麩分別占發酵底物的80%、20%，葡萄糖2%，（NH4）2SO41%，固水比1∶0.5，pH值7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種培養

菌種活化：將保存于冰箱的斜面種子接種于新鮮斜面培養基上，37℃恒溫培養36 h。

液體種子培養：將培養36 h的斜面種子分別接種于液體種子培養基中，37℃，150 r/min條件下振蕩培養18～24 h。

發酵培養：按5%的接種量（V/W）接種于裝量為50 g/250 ml三角瓶發酵培養基中，混合均勻后，置于30℃恒溫培養箱中培養5 d，培養過程中從培養開始每24 h搖動1次。

1.2.2 單因素條件研究

培養方法與1.2.1節相同，替換不同的條件，即棉粕與麥麩的比例、葡萄糖含量、（NH4）2SO4添加量、發酵溫度、初始pH值、含水量、接種量、發酵時間、裝量等，測定不同條件下各營養成分的變化情況。每處理3個重復。

1.3 測定及分析方法

1.3.1 蛋白質含量測定

全自動凱氏定氮儀（FOSS），kjeltecTM 2300。

1.3.2 淀粉酶活力的測定

采用顧賽紅[7]報道方法，即3、5-二硝基水楊酸法測定。酶活定義為:在40℃條件下，每分鐘催化可溶性淀粉水解生成1 μmol麥芽糖所需要的酶量為1個酶活力單位（U/g）。

1.3.3 脂肪酶活力的測定

采用張海燕[8]報道方法，即銅皂法測定。酶活定義為：在37℃條件下，每分鐘催化脂肪水解產生1 μmol脂肪酸的脂肪酶量定義為一個脂肪酶國際單位(U/g)。

1.3.4 數據處理分析

試驗結果使用SPSS17.0統計軟件，Duncan氏多重比較檢驗均值的差異顯著性,當P＞0.05時,表示差異不顯著，當P＜0.05時,表示差異顯著，結果用平均值(M)±標準誤(SE)表示，用Excel 2000進行圖表分析。

2 試驗結果與分析

2.1 發酵培養基的篩選

2.1.1 棉粕與麥麩比例對發酵產物營養成分的影響

改變發酵培養基棉粕與麥麩的比例（100∶0；95∶5；90∶10；85∶15；80∶20；75∶25），30℃恒溫培養5 d，發酵料低溫烘干后，測定粗蛋白含量及淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶酶活（見圖1）。

圖1 棉粕與麥麩比例對發酵棉粕營養成分的影響

從圖1可知，粗蛋白含量、淀粉酶活力、脂肪酶活力隨培養基中麥麩比例增加而升高，當棉粕與麥麩的比例為90∶10時，達到最高，粗蛋白含量達到39.41%；淀粉酶活力746 U/g，與其他比例條件下相比達到最高；脂肪酶活力比發酵前的249提高了132 U/g，達到381 U/g。隨后增加培養基中麥麩的比例，粗蛋白含量隨之降低，兩種酶活明顯降低，因此，選擇棉粕與麥麩的比例為90∶10。

2.1.2 葡萄糖含量對發酵產物營養成分的影響

按質量比在培養基中分別加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的葡萄糖，以不加葡萄糖為對照組，其它條件不變，見圖2。

圖2 葡萄糖含量對發酵棉粕營養成分的影響

從圖2可以看出，發酵培養基中加入葡萄糖對粗蛋白含量的影響較大。培養基中隨著葡萄糖含量增加，粗蛋白含量下降較快，對提高營養成分含量不利。葡萄糖含量對淀粉酶活力影響較小，但淀粉酶活力、脂肪酶活力都隨添加量的增加而降低。因此，發酵過程中不需要在培養基中加入葡萄糖作為微生物生長的速效碳源。

2.1.3 硫酸銨含量對發酵產物營養成分的影響

分別在培養基中加入不同質量比的硫酸銨(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)，以不加硫酸銨為對照，見圖3。

圖3 硫酸銨含量對發酵棉粕營養成分的影響

從圖3可以看出，在一定范圍內，發酵培養基中隨著(NH4）2SO4含量的增加，營養成分含量也隨之增加。當發酵培養基中(NH4）2SO4含量為1%時，發酵產物中粗蛋白與不添加硫酸銨對照組的39.97%相比提高了0.58%，達到40.55%；淀粉酶活力比對照組748 U/g提高了103 U/g，達到861 U/g；脂肪酶與對照組相比提高了82 U/g,達到最高474 U/g。當(NH4）2SO4含量超過1%，營養成分呈下降趨勢。(NH4）2SO4作為微生物生長的速效氮源，在發酵前期，對微生物的生長有利，但發酵培養基中(NH4）2SO4的含量過高，改變了培養基的碳氮比，導致微生物大量生長而不分泌或少分泌某些酶類，從而影響了各成分含量。

2.2 發酵條件對發酵產物營養成分的影響

2.2.1 溫度對發酵產物營養成分的影響

將發酵培養基分別置于30、35、40、45℃恒溫培養箱中培養5 d，結果見圖4。

圖4 發酵溫度對發酵棉粕營養成分的影響

溫度是微生物生長和產生代謝產物的重要影響因素之一，合適的發酵溫度，有利于微生物的生長和代謝。從圖4可知，在30～40℃范圍內，粗蛋白含量，淀粉酶、脂肪酶活力隨溫度的升高而提高。當發酵溫度為40℃時，達到最高，但隨著發酵溫度的進一步升高，各成分隨之下降，可能是因為高溫抑制了微生物產生酶所致。

2.2.2 pH值對發酵產物營養成分的影響

調節發酵培養基的pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，結果見圖5。

圖5 pH值對發酵棉粕營養成分的影響

從圖5可以看出，發酵培養基的初始pH值為6.0時，粗蛋白含量為42.10%、淀粉酶活力1 037 U/g、脂肪酶活力548 U/g，較其他pH值條件下達到最高水平。當pH值為8.5時，發酵產物中的各營養成分最低。初始pH值大于6.0，發酵培養基中的各成分隨之下降，其原因有待進一步研究。

2.2.3 含水量對發酵產物營養成分的影響

調整發酵培養基的含水量為30%、35%、40%、45%、50%、55%，40℃恒溫發酵5 d，結果見圖6。

從圖6可以看出，隨著發酵料中含水量的增加，粗蛋白含量也在增加，淀粉酶、脂肪酶酶活也隨之提高，當含水量為50%時，粗蛋白含量達到40.99%，淀粉酶酶活887 U/g，比未發酵前540 U/g提高了347 U/g；脂肪酶活力比發酵前提高了233 U/g。但含水量超過50%，各成分下降明顯。主要原因為發酵料中過高的含水量，可降低發酵料中氧氣濃度，從而導致厭氧發酵，影響營養成分含量提高。

圖6 含水量對發酵棉粕營養成分的影響

2.2.4 接種量對發酵產物營養成分的影響

按菌種接種量分別為（V/W）2%、3%、4%、5%、6%、7%接入發酵培養基中，結果見圖7。

圖7 接種量對發酵棉粕營養成分的影響

接種量的大小可直接影響發酵進度和代謝產物的生成量。接種量太小，延長發酵時間及增加雜菌污染的機會；接種量太大，可導致發酵前期營養物質消耗過快，不利于產物的形成和毒性物質的降解。圖7結果表明，當接種量為6%時，發酵料中粗蛋白含量達到42.63%；淀粉酶活力1 158 U/g，比其他接種量條件下活力提高明顯，與發酵前相比提高了618 U/g；脂肪酶活力比發酵前提高289 U/g，達到了538 U/g。但增加接種量，營養物質含量下降。

2.2.5 裝量對發酵產物營養成分的影響

250 ml三角瓶中分別裝入30、40、50、60、70、80、90 g固體發酵培養基，結果見圖8。

圖8 裝量對發酵棉粕營養成分的影響

圖8表明，當250 ml三角瓶中裝入70 g發酵培養基時，粗蛋白含量、淀粉酶活力、脂肪酶活力與其他裝量條件下相比，達到最高值，分別為42.94%、1 314 U/g、546 U/g。

2.2.6 發酵時間對發酵產物營養成分的影響

在得到的上述最優條件下，分別發酵3、4、5、6、7 d，結果見圖9。

圖9 發酵時間對發酵棉粕營養成分的影響

從圖9可以看出，隨著發酵時間的延長，發酵料中營養成分的含量和酶活也隨之提高，到發酵第6 d，粗蛋白含量43.76%；淀粉酶活力1 306 U/g,提高了766 U/g；脂肪酶活力548 U/g，提高了299 U/g。發酵4 d，脂肪酶活力提高最低，比發酵前只提高了251 U/g。發酵3～5 d，淀粉酶活力、粗蛋白含量變化不明顯。但隨著發酵時間的延長，營養物質含量反而降低，主要原因是微生物代謝消耗所致。

2.3 正交試驗結果分析

在單因素試驗的基礎上，選用（NH4）2SO4添加量、物料含水量、發酵溫度和發酵時間作為考察的4個因素，分別選取3個水平，以粗蛋白含量、淀粉酶活力、脂肪酶活力為考察指標，結果見表1。

根據表1結果可知，處理4的粗蛋白含量顯著高于其他8組處理及未發酵對照組(P＜0.05)，其他8組處理的粗蛋白含量也都極顯著高于對照組(P＜0.05)。9組處理的淀粉酶活力均顯著高于對照組(P＜0.05)，處理組1、2、3、5、6、7、8、9之間淀粉酶活力不存在顯著性差異（P＞0.05），處理4最高為1 306 U/g，顯著高于其他組處理（P＜0.05）。纖維素酶活力9組處理都顯著高于對照組(P＜0.01)，處理1、2、3、7、8組間無顯著差異（P＞0.05），處理5、6組間也不存在顯著差異（P＞0.05），處理4活力較高，顯著高于其他組（P＜0.05）。9組處理脂肪酶活性均顯著高于對照組(P＜0.05)，處理4脂肪酶活性最高達548 U/g，顯著高于其他處理組（P＜0.05），處理組1、2、3和5之間不存在顯著差異（P＞0.05），處理組6、7和8之間也不存在顯著差異（P＞0.05）。由粗蛋白含量、淀粉酶活力和脂肪酶活力及極差分析可得出：A2B1C2D3為最佳設計方案，即（NH4）2SO4添加量1%，含水量50%，發酵溫度40℃，發酵時間6 d。棉粕發酵后CP提高6.99個百分點、淀粉酶活力提高766 U/g、脂肪酶活力提高299 U/g，均顯著高于未發酵對照組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 微生物固態發酵棉粕后蛋白質含量變化

五株芽孢桿菌和酵母菌發生協同作用，使得微生物大量繁殖，向細胞外分泌一定量的多肽、酶蛋白等物質，同時利用底物及非蛋白氮合成大量菌體蛋白[9]。由試驗結果可知，發酵產物中，粗蛋白提高了6.99個百分點，比張慶華等報道提高的2.29%又提高了4.70個百分點，主要原因是微生物生長繁殖過程中消耗底物而導致發酵物的絕對含量減少和微生物利用非蛋白氮合成菌體蛋白，從而提高了發酵產物中粗蛋白含量[10]。

3.2 微生物固態發酵棉粕后酶活性變化

芽孢桿菌株在其生長繁殖過程中能夠產生淀粉酶、纖維素酶和少量脂肪酶等酶類[11-12]。酵母菌能產生氨基酸、維生素(K、B、泛酸、煙酸、生物素、肌醇和葉酸等)[13-15]。微生物發酵產生的各種消化酶、氨基酸、維生素等也大大提高了棉粕的營養價值。在最佳發酵條件下，發酵產物中淀粉酶活力較發酵前的540 U/g提高了766 U/g，脂肪酶較發酵前的249 U/g提高了299 U/g。

3.3 微生物固態發酵棉粕的最佳條件

以粗蛋白含量、總游離氨基酸含量、淀粉酶活力、脂肪酶活力和纖維素酶活力作為固態發酵效果的評價指標，對復合芽孢桿菌和酵母菌共同固態發酵棉粕的組成及其配比，添加碳源、氮源種類及濃度，培養基的含水量進行了優化，得到固態發酵最佳條件為：棉粕∶麥麩為90∶10，（NH4）2SO4添加量1%，發酵溫度40℃，物料含水量50%，接種量6%，裝量為70 g/250 ml三角瓶，發酵時間6 d。

表1 L9（34）正交試驗及結果

本試驗按照得到的最優水平又進行了堆積發酵底物1 t驗證，結果與預測結果接近，說明優化結果是可信的，具有較強的生產指導意義,為棉粕在畜牧水產養殖業中利用多菌種、多重發酵技術生產生物飼料提供了一條新途徑。

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