甜菜黃化病毒病的研究進展

王 麗，鄭 毅，卞桂杰

（吉林省農業(yè)科學院經濟植物研究所，公主嶺136105）

甜菜黃化病毒病在美國 （1951）最先流行[1]，屬于井上忠男等 （1973）[2]記載的甜菜黃化病毒屬（closterovius）。該病毒由蚜蟲介導進行半持久性傳播，目前分布于世界大部分甜菜產區(qū)，包括歐洲、南北美洲、亞洲及澳洲。在我國的東北、內蒙古、甘肅、寧夏、新疆、河北、山西、陜西等地均有大范圍發(fā)生，并有進一步蔓延的趨勢。有研究表明甜菜黃化病毒病一般年份的發(fā)病率50%～60%，塊根減產20%～25%，含糖率下降2%～3%，染病種子減產30%，已經成為影響全世界甜菜生產的主要限制因素之一[3－7]。

1 甜菜黃化病毒病癥狀

經調查，根據(jù)甜菜黃化病毒病在甜菜上的癥狀表現(xiàn)可分為花葉型、黃化型、壞死黃脈型（具叢根癥狀）和黑色焦枯型4大類型，其中花葉型又分為黃色泡斑花葉、系統(tǒng)環(huán)斑花葉和黃脈皺縮花葉3個類型。

因為甜菜黃化毒病是系統(tǒng)性病害，田間植株染病后往往下層靠近底部的葉片首先表現(xiàn)出癥狀。靠近葉尖、葉緣部分出現(xiàn)清晰的明脈，隨著葉脈間組織失綠，邊緣出現(xiàn)不明顯的漩渦狀鮮黃色斑，黃斑隨后擴大連成片，向葉底部發(fā)展，除葉脈外其余部分變成具金屬光澤的黃色，有時呈現(xiàn)類似大理石狀斑紋，一天后全葉變成黃色，葉片變黃并增厚、僵硬，質地變脆，易折斷。病葉膨壓增加，蒸騰作用減少，在干旱條件下仍不發(fā)生萎蔫，盛夏中午田間健全葉萎蔫下垂時病葉仍向上直立，嚴重病葉主脈上可見有維管束壞死變黑狀。病葉全變黃。漸轉變?yōu)轺龅纬蔁o數(shù)黑褐色枯斑，病斑近“回”形或不規(guī)則狀，有時有輪紋，病葉最后枯萎卷曲而死。采種株癥狀與一年生甜菜相同。

2 甜菜黃化病毒病的寄主植物、傳播途徑和流行原因

2.1 寄主植物

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)15科121種植物受其感染，可系統(tǒng)侵染甜菜、菠菜、亮色藜、西風古、歐千里光和番杏，局部侵染墻生藜等。保存和繁殖該病毒的最好寄主是番杏和甜菜[8]。

2.2 傳播途徑

黃化病毒主要在采種母根和藜科、莧科雜草上越冬，成為初次侵染來源。一般先在采種母株上發(fā)病，再由至少22種蚜蟲以半持久性傳播到原料甜菜地里，包括豌豆蚜、蠶豆蚜、棉蚜、甘蔗蚜、馬鈴薯長管蚜等[8]。在田間的兩個主要介體是桃蚜和豆蚜。病毒不能傳播到子代蚜蟲，蚜蟲蛻皮后不帶毒。病毒不能經過種子傳播，可以機械傳播，但是極為困難。

2.3 甜菜黃化病毒病流行原因

甜菜黃化病毒病的流行發(fā)生受綜合因素的影響，年度間發(fā)病輕重不同的主要原因是品種抗性，田間發(fā)病輕重不同的主要原因是栽培管理技術。肥、水量供應、密植程度和發(fā)病亦有關系。缺磷鉀肥的甜菜，發(fā)病較嚴重，而多施用綠肥和廄肥的甜菜，發(fā)病則較輕。冬季寒冷的國家，病毒的介體蚜蟲不能在戶外過冬，發(fā)病率低。

3 甜菜黃化毒病的致病機理

3.1 黃化病毒種類

甜菜黃化病毒病的病原有兩種，壞死型黃化病毒和溫和型黃化病毒，其傳播方式，引起癥狀有所不同，通常兩種病毒混合侵染。

壞死型黃化病毒又叫甜菜黃化病毒（beet yellows virus，BYV），它使葉片發(fā)生檸檬黃色，繼而出現(xiàn)帶紅色病斑，并蔓延聚成片，為半宿存式傳播。

溫和型或微弱型黃化病毒（beet mild yellowing virus，BMYV）僅進行宿存式傳播，病原通常從葉尖侵入，發(fā)生枯黃色變，易導致黑斑病菌（交鏈孢菌）的二次侵染。另外BMYV的變種BWYV（beet western yellows virus）又稱甜菜西方黃化病毒，美國與日本發(fā)生的是BWYV，新疆為BYV和BWYV。

3.2 黃化病毒病原

黃化病毒是具有特別長絲狀的病毒粒子，這些病毒顆粒主要成分是由衣殼蛋白和一條單一的正義RNA組成。內含一個編碼的熱休克蛋白HSP70的基因，參與病毒的繁殖、病毒RNA運輸?shù)冗^程。絲狀體直徑10～12 nm，長1.25μm。病毒體外存活期2～3d。52℃經10 min致死。稀釋限點 1萬倍[9－10]。病毒在甜菜葉部、葉柄、莖、篩管的柔膜細胞的細胞質中寄生，根細胞也有。病毒侵染后破壞細胞原有生理活動，破壞葉綠體，葉綠素含量急劇下降，光合作用受阻。病毒在葉脈團聚，葉脈、葉柄輸導組織維管束被堵塞、破壞，造成淀粉積累，利于交鏈孢菌等腐生菌的侵染，維管束壞死變黑，葉部光合產物不能輸送到根部，使塊根產量和含糖量增長受到抑制。

4 病毒檢測方法

4.1 昆蟲介體接種法

由于BYV不能通過人工摩擦接種和機械傳毒，因此，需利用蚜蟲進行接種，然后調查植株的癥狀以鑒定BYV。此方法是常用的鑒定方法，操作比較簡便。但其特異性較差，往往存在一病多癥、多病一癥的現(xiàn)象；而且易受季節(jié)限制，檢測周期長（1～2個月），易受到生長條件、氣候、土壤等外界環(huán)境的影響。因而應用該技術檢測病毒靈敏性較差，難以區(qū)分病毒種類。

4.2 電鏡法

利用病毒特異性抗體誘捕或包被病毒粒體，產生免疫吸附反應，采用電鏡法從病株上檢出BYV粒體，即利用已知的病毒抗體對感病的樣本進行檢測，觀察抗體抗原反應來鑒定BYV的分離物，但多數(shù)情況下檢出數(shù)量少，有時還不能確切斷定有無感染。因而，有研究改用免疫電鏡法（SSEM），可有效地檢測純化的BYV分離物，但最佳抗原稀釋度很難掌握。仍有很多雜質附著在膜上，對粗提物的檢測不是很準確。因此，這種條件對BYV檢出不太適合。

4.3 血清學檢測技術

植物病毒衣殼蛋白（CP）具有抗原性，很多病毒可以被提純并制成高效價的抗血清。根據(jù)特異性的抗體抗原免疫學反應可檢測植物病毒的存在。血清學方法的發(fā)展推動了植物病毒檢測技術的發(fā)展。甜菜、蕪菁、大麥、茄子黃化病毒均采用此法。通過單克隆抗體，采用異種動物雙抗夾心法[11]或間接三層夾心法[12]來達到檢測BYV的目的。此外酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術對不同黃化病毒的鑒定已在相當多的禾本作物和雜草中有了應用。但是ELISA檢測中，血清學存在假陽性結果。

4.4 PCR、RT-PCR和標記探針技術

PCR和RT-PCR是一種檢測RNA病毒行之有效的方法。近年來在病毒檢測領域得到廣泛的應用。可以檢測植株中黃化病毒并快速鑒別出BYV和BWYV。PCR和RT-PCR分子檢測技術以其靈敏性高，無放射性等優(yōu)點，正廣泛應用于甜菜植株和介體蚜蟲體內的BYV的病毒檢測。

根據(jù)互補的核酸單鏈可以相互結合的原理，將標記探針與互補的待測病毒核酸雜交，帶探針的雜交物指示病原物的存在。近年來應用非放射性探針分子，如生物素或地高辛標記的探針分子更安全，應用限制少，壽命更長，與放射性標記的探針一樣靈敏實用。此方法靈敏度高，可以對低濃度的BYV進行檢測。

5 抗黃化病毒病育種

5.1 甜菜黃化病毒的抗源

BMYV的抗源在野生和栽培甜菜中均可獲得，但是，雖然有耐病品種等可供選用，因其抗性為隱性，易受環(huán)境影響。截至目前，育種工作者仍未找到BMYV抗源。通過遺傳工程得到的純化BMYV甜菜抗源材料并得以實際應用的研究也尚未見報道

選育抗病品種是防治BMYV最為經濟環(huán)保有效的方法。傳統(tǒng)的抗黃化病毒甜菜育種是以回交、自交等方法選育出的兼抗兩種或兩種以上的病毒病甜菜品種。目前，國內外還未發(fā)現(xiàn)抗病品種，已經篩選出了較抗病的品種工農2號、內蒙古3號、甜研3號等和耐病性的品種如新甜系列、蘇墾系列和德國KWS5007、5075等。東部甜菜栽培區(qū)推廣的優(yōu)良品種有甜研304、甜研309，荷蘭RIMA和德國KWS0149主要用于紙筒育苗移栽。大田選用的KWS、RIMA是世界公認的遺傳耐病種質。從大面積觀察來看，國產品種抗病力優(yōu)于國外品種；國內和國外合作育出的品種又優(yōu)于國外品種。

5.2 基因工程技術在抗甜菜黃化病毒病育種上的應用

Pink等[13]在萵苣品種Burs17和Crysta L heart上發(fā)現(xiàn)了抗BYV基因。Casper等[14]已從BWYV克隆cDNA和CP序列，構建了基因。英國劍橋研究人員發(fā)現(xiàn)了抗蚜蟲基因和野生種中抗黃化病毒基因，可用來阻止黃化病毒的轉移和傳播，將用于育種研究抗CMV分子育種。甜菜黃化病毒是一種線狀病毒，其病毒組的最突出特點之一是它們都含有一個編碼的熱休克蛋白HSP70的基因。因此識別與HSP70相結合的其他蛋白質對研究甜菜黃化病毒具有重要意義。金紅等利用酵母雙雜合體系統(tǒng)，表達質粒檢測了甜菜黃化病毒蛋白質間相互作用[15]。葉克窮和Dinshaw J.Patel編碼了甜菜黃化病毒的抑制基因p19和p21，阻止直接結合的siRNA，在這個過程中關鍵的調解使黃化病毒基因沉默[16]。為分子水平上提出病毒防治機制提供一定的理論基礎。

6 小結與討論

本文對BYV的發(fā)病癥狀和致病機理、甜菜黃化病毒病檢測的方法、危害情況和抗病育種等最新研究進展進行了綜述。對于有效防治BYV的發(fā)生具有重要意義。在理論上，甜菜黃化是由病毒造成的。在生產實際上，造成甜菜黃化的原因存在爭議。有部分研究人員認為是生理現(xiàn)象，也有部分研究人員則認為是由病毒所引起的。因此，不論是在理論方面，還是在生產方面，該問題都急待解決[17-18]。利用分子生物學方法進行抗黃化病毒育種在煙草、番茄上運用較多[19-20]，一些抗黃化病毒疫苗也已經投入市場。國內在甜菜上的運用鮮有報道。但是相關研究報道對甜菜的抗病分子育種提供了理論基礎，越來越豐富的抗性材料對于缺乏抗源的BMYV抗性育種是未來研究的關鍵。

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