抗花葉病轉基因甘蔗安全性評價

張 鈴，楊川毓 ，郭 鶯，阮妙鴻，林新期，陳如凱，張木清

（1.福建農林大學甘蔗研究所，福州 350002；2.福建省亞熱帶植物研究所，廈門 361002；3.福建省農業廳，福州 350003）

甘蔗花葉病是一種由病毒侵染引起的世界性甘蔗病害，主要破壞甘蔗葉片的葉綠體，嚴重制約其光合作用，從而使甘蔗的生長受到限制，糖分減少，產量下降。研究發現當花葉病病毒侵染率達到75%時，產量降低5%～19%[1]。選育和利用抗病品種是控制甘蔗花葉病的根本措施，但由于甘蔗是異源多倍體，遺傳背景復雜，常規條件下難以開花。因此傳統甘蔗抗病育種手段不僅周期長且效率低。Powel-Abel（1986）[2]最先報道了將TMV-CP基因導入煙草中獲得對TMV（煙草花葉病毒）具有抗性的轉CP基因煙草，為甘蔗抗花葉病基因工程育種提供了新的思路。澳大利亞Smith等（1996）[3-5]采用基因槍將甘蔗花葉病毒外殼蛋白（ScMV-CP）基因轉化到甘蔗的莖分生組織獲得了嵌合型的轉化植株，檢測表明外源基因已整合到甘蔗基因組中。Ivan L.Ingelbrecht（1999）等[6]以CP65-357和CP72-1210為受體，利用基因槍轟擊將高粱花葉病毒基因轉入甘蔗體內。本實驗室（2003；2007）通過基因槍分別將ScMV-CP基因與SrMV-P1基因轉入甘蔗品種拔地拉（Badila）與福農95-1702中，經分子鑒定，目的基因已整合到甘蔗基因組中，且抗病鑒定結果表明轉基因甘蔗對甘蔗花葉病抗病能力明顯提高[7-8]；后對其3年的田間發病率調查顯示轉基因甘蔗的發病率均低于5%。

目前有關獲得甘蔗抗花葉病轉基因甘蔗的報道不斷增多，與其他轉基因植物一樣，其生物安全性的問題也引起了許多爭論。近年，陸續出現了許多有關轉基因植物生物安全的報道，但有關抗花葉病轉基因甘蔗的研究報道卻十分少見。抗花葉病轉基因甘蔗與其他轉基因材料有許多共同點，也存在許多不同點。因此，本文擬從抗花葉病轉基因甘蔗的食品安全、土壤生態安全、基因漂移、病毒的異源包裝與重組以及雜草化等方面進行逐一論述。

1 抗花葉病轉基因甘蔗的食品安全

抗花葉病轉基因甘蔗的外源基因是來源于甘蔗花葉病毒本身。有研究表明：甘蔗花葉病毒的熱鈍化溫度為53～55℃[9]。熱鈍化溫度是指使病毒喪失侵染力的最低溫度。作為蔗糖和酒精生產主要工業原料的甘蔗，其加工過程都需要經過高溫煉煮。因此，在甘蔗的加工過程中，其體內的核苷酸與蛋白都已經失活，對最后產生的產品蔗糖和酒精可能不造成影響。但對于在加工過程中抗花葉病轉基因甘蔗的內源毒素降解是否會對其重要的營養素造成影響，還有待進一步研究和觀察。

甘蔗除加工制糖、生產酒精外，也可以作為果蔗直接食用。抗花葉病轉基因甘蔗所插入的相關病毒基因和標記基因以及抗生素的抗性基因等是否會對人的身體健康有所影響引起人們的很大關注。目前許多研究表明：在轉基因植物中病毒蛋白的表達，并不會給人類帶來不良的反應，尤其值得注意的被病毒侵染的植物仍然作為食品被人們所消費，但還沒有見到其給人類帶來不良影響[10]。而目前抗花葉病轉基因甘蔗中常用的篩選標記基因是npt II。Fuchs等（1993）[11]對nptⅡ基因進行過嚴格的安全性評價，結果表明nptⅡ蛋白不會帶來安全問題。近年來，一些安全性標記基因（如pmi基因）在轉基因甘蔗上得到使用，也在一定程度上提高抗花葉病轉基因甘蔗的食品安全性[12]。抗花葉病轉基因甘蔗中所用到的標記基因中包括抗生素抗性基因。目前學者普遍認為標記基因是安全的，但是抗生素的抗性基因可能會轉移到人體的腸道微生物或者上皮細胞中，從而對人體產生不利影響或者降低抗生素在臨床治療中的有效性。FDA（1994）對卡那霉素抗性基因Kanr的研究表明：抗生素的抗性基因不會引起安全性問題[13]，而且目前也沒有報道指出抗生素的抗性基因對人體有毒害作用。但是，抗花葉病轉基因甘蔗的食品安全性研究不能局限于此，仍要通過受體植物與供體生物歷史背景的分析、營養成分的評價、生物信息學分析、分子生物學技術、毒理學評價、致敏性評價等方面進行多層次、多角度的探討[14]。

2 抗花葉病轉基因甘蔗對土壤生態環境的影響

土壤是生態系統中物質和能量轉化的主要場所，并且作為植物生長的媒介，其生態功能不容忽視。因此，土壤中物質代謝，主要微生物種群變化以及生物多樣性的穩定性，是保證土壤生態功能正常、穩定的前提基礎[15]。轉基因甘蔗與其親本在遺傳性狀、生理代謝、以及相關基因的表達產物上存在一定的差異，外源基因可能通過根系分泌物進入到土壤生態環境中，從而產生一些不可預測的影響。

2.1 對土壤物質代謝的影響

氮、碳、磷代謝是土壤物質代謝中的三大代謝，與其相關的脲酶、蔗糖酶、磷酸單脂酶等酶活性發生異樣，可能導致氮、碳、磷三大代謝發生混亂，從而一定程度上影響土壤對有機質的分解、土壤生物的生態過程以及土壤結構和肥力水平[16]。轉基因甘蔗由于其外源基因導入，可能會對土壤物質代謝造成一定的影響。阮妙鴻等研究表明：轉ScMV-CP基因甘蔗顯著（p＜0.05）降低了土壤脫氫酶的活性，提高了土壤的纖維素酶、蛋白酶和脲酶活性（p＜0.01），而對蔗糖酶和磷酸單脂酶沒有影響[17]。付云霞（2007）對轉SrMV-P1基因甘蔗在不同栽培方式，不同生育期進行研究表明：轉SrMV-P1基因甘蔗對根際土壤脲酶和酸性磷酸酶的活性影響很小，而對蔗糖酶、堿性磷酸酶和過氧化氫酶的活性皆有一定的影響[18]。鄭碧霞（2008）在付云霞的基礎上，對轉SrMV-P1基因甘蔗進行跟蹤研究表明：轉SrMV-P1基因甘蔗對根際土壤脲酶、蔗糖酶、堿性磷酸酶活性相比受體材料差異不顯著，而對酸性磷酸酶有一定的影響[19]。

綜上所述，導入不同的外源基因，可能使抗花葉病轉基因甘蔗對土壤代謝造成不同的影響。但由于影響土壤酶活性的因素眾多，所以不同的試驗，所受到的影響因素不同，可能得到不同的結果。且土壤酶活性的差別也可能是由植物生理特性的不同所引起。因此，目前有關抗花葉病轉基因甘蔗是否會給土壤中與氮、碳、磷相關代謝的酶造成影響，從而破壞土壤中正常的物質及能量轉化，還有待進一步研究。

2.2 對土壤微生物種群的影響

抗花葉病轉基因甘蔗進入土壤后，土壤中的微生物利用植物根際分泌物進行自身的生長繁殖，它們之間相互作用且相互影響。主要體現在：土壤微生物分解土壤有機質和促進腐殖質形成；吸收和固定并釋放養分，對植物營養狀況的改善和調節有主要作用；與植物共生、促進植物生長等[20]。另外，土壤微生物特性對土壤基質的變化敏感，其群落結構組成等可以反映土壤肥力狀況。因此，近年來把土壤微生物群落結構的組成作為評價土壤健康的主要指標[15]。

阮妙鴻等通過盆栽、田間種植及人工殘體掩埋，利用BIOLOG Ecoplate TM微平板（BIOLOG Inc.，USA）結合微生物的平板培養及相關的土壤酶活性分析，研究了轉ScMV-CP基因甘蔗對根際土壤微生物的影響。研究發現，轉基因甘蔗對土壤微生物數量和均勻度有一定影響，但對活性和多樣性的影響不明顯[21]。而付云霞（2007）通過對轉SrMV-P1基因甘蔗不同生育期根際土壤微生物的研究表明，轉SrMV-P1基因甘蔗對根際土壤放線菌和真菌的影響較為復雜，但對根際細菌的影響很小[18]。鄭碧霞（2008）通過跟蹤研究表明：轉SrMV-P1基因甘蔗對根際土壤細菌和放線菌存在顯著差異，但對真菌數量差異不明顯[19]。因此，有人認為可能是由于外源基因蛋白在土壤根際的表達，引起土壤微生物種群的變化[22]。也有人認為，轉基因作物對土壤特定微生物產生的顯著影響可能是由轉基因植株的形態學上以及其生理生化特性的改變而引起[22]。但也有一些報道發現轉基因作物對土壤生物不會帶來影響[23]。迄今為止的研究結果可以看出，抗花葉病轉基因甘蔗對土壤生物群落的影響比較復雜且無規律可循，不同遺傳背景的轉基因甘蔗生長環境不一樣，皆可能對土壤微生物造成迥異的影響。因此，抗花葉病轉基因甘蔗對土壤微生物種群影響的研究應該進行長年的追蹤研究及更深入的探討。

3 抗花葉病轉基因甘蔗基因漂移的研究

所謂基因漂移，是指一種生物的目標基因向附近野生近緣種的自發轉移，導致附近野生近緣種發生內在的基因變化，具有目標基因的一些優勢特征，形成新的物種，以致整個生態環境發生結構性的變化。花粉傳播是轉基因植物的外源基因發生漂移的主要途徑[24]。甘蔗作為一種無性繁殖作物，通常情況下不易開花，因此，很少存在由于花粉引起的外源基因漂移。但是，外源基因還可以通過重組、復制、轉導、轉化和轉位等途徑在微生物之間相互轉移，在植物與微生物之間也會自然發生[25]。Hofmaan等[26]證實了轉基因植物中的外源基因也會水平轉移到其它微生物中，轉基因油菜、黑芥菜、蒺藜和甜豌豆中抗生素基因可通過轉基因植株的根系分泌物轉移到一種能與植物共生的黑曲霉微生物中。因此轉基因植物也存由于基因的水平轉移所帶來的風險。

但是，也有學者認為：外源基因水平轉移的可能性是十分小的，理由為：①DNA從植物細胞中釋放出來后，很快被降解成小片段，因此植物DNA進入有腸道微生物存在的小腸下段、盲腸和結腸前已被降解。②即使有完整的DNA存在，DNA轉移整合進入受體細胞并進行表達也是一個非常復雜的過程。目前尚未發現消化系統中有外源基因轉移至腸道微生物的現象。Nielsen等[27]對種植轉nptⅡ基因的甜菜的土壤進行測定，發現在滅過菌的土壤中發生轉化的幾率為1.4×10-8，而在未滅菌的土壤中未檢測到有轉化菌株。對種植轉nptⅡ基因甜菜的土壤進行測定，并未發現含有或表達該基因的土壤微生物[28]。周琴等[29]研究也沒有發現轉基因作物中的Bt cry1 Ac10基因向土壤中的細菌、真菌和放線菌轉移。因此，在土壤中，基因的水平轉移即使發生，其頻率亦應很低。另外需要指出的是，自然土壤生態系統中微生物豐富多樣，具有強大的緩沖能力，因而人工引入或外來的微生物很難與其競爭；這一事實使得許多土壤微生物學家對轉基因植物的基因水平轉移問題備感樂觀；但今后隨著新的外源基因的不斷引入和廣泛使用，其所產生的基因流動問題仍需高度關注[30]。

4 抗花葉病轉基因甘蔗病毒的異源包裝和重組

目前對于轉抗病毒作物是否會導致新型病原體的產生，主要有兩方面的安全擔憂：一是病毒的異源包裝或稱轉移包裝；二是病毒的異源重組。

4.1 病毒的異源包裝

病毒異源包裝是病毒的基因組被其他病毒的外殼蛋白所包裹，這種現象通常是在植株受多種病毒侵染時發生。例如，病毒的異源包裝也可能是已經轉了其他相關的病毒基因的甘蔗，又轉入了CP基因，病毒的基因被CP的外殼蛋白包裹而引起病毒特性的改變。因為CP基因在眾多的因素中對致病性與載體的特異性具有決定性，而使得原先轉入其他相關病毒基因的甘蔗特性有可能發生改變[10]。這可能會給轉基因甘蔗帶來嚴重的危害。目前關于轉基因植物中出現病毒的異源包裝已有很多報道[31-33]。

4.2 病毒的異源重組

重組是兩種不同的DNA分子在復制過程中遺傳物質的交換。重組也可能發生在抗花葉病轉基因甘蔗中病毒基因與活性病毒基因的復制過程中。重組后的病毒可能包括轉抗病毒基因甘蔗中的抗生素基因和活性病毒基因組片段。因為重組改變了活性病毒的基因組，同時也改變了病毒的相關性質。這些經過重組后的病毒可能會給生態環境帶來一些負面影響。例如轉播媒介的改變、宿主范圍的擴大、以及致病性的增強等等。已有許多研究報道了在轉基因植物中出現了病毒的重組[34-39]。

目前，絕大多數抗花葉病轉基因甘蔗都是通過導入CP基因以及甘蔗花葉病毒上的相關基因，來提高其抗病性。在提高甘蔗抗病性的同時，也要重視抗花葉病轉基因甘蔗所帶來的一些負面影響。而有關抗花葉病轉基因甘蔗上的病毒的異源包裝和重組研究少之又少，因此，對這方面的研究應該引起足夠的重視。

5 轉抗甘蔗花葉病基因甘蔗雜草化的研究

由于雜草難以防除，且對農業生產造成重大經濟損失，所以轉基因作物是否會雜草化是評價轉基因環境安全的一個重要指標。通過基因工程手段插入外源基因，從而使作物可能具有更強的生存競爭能力。并且有些作物（例如甘蔗）本身就具有雜草性，若將它們作為受體材料，可能增加其演變成雜草的概率。但由于甘蔗是經過人類長期的馴化培育而成，已基本喪失了雜草的遺傳特性，僅靠一兩個外源基因就使得他們轉變成雜草的可能性非常的小[40]，即使抗花葉病轉基因甘蔗在抗花葉病方面比親本具有較大的優勢，但一旦當它離開了特定的選擇壓力后，其競爭優勢也會立即喪失。并且從目前水稻、玉米、棉花、大豆等轉基因植物的田間調查來看，轉基因植物的生存競爭能力并不比非轉基因植物強，也沒有演變成農田雜草。

但也有一些例子表明轉基因植物可能轉變成雜草。加拿大轉基因油菜在麥田中變成了雜草[41]，且難以治理。而黑麥草、牛筋草、小白酒草、多花黑麥草、香絲草、車前子6種雜草表現出了對草甘膦的抗性，也是由Roundup Ready類轉基因作物引起的[42]，說明轉基因作物基因漂移到雜草上，導致雜草抗性的產生。

因此通過一些手段來預防轉基因作物的雜草化是必要的。主要通過隔離手段和生物手段，前者是制造空間和時間上的距離來防范，后者通過使種子不育、雄性不育、葉綠體母系遺傳、閉花受精和無融合生殖等遺傳學手段來控制[43]。

6 小結與展望

隨著現代生物技術的興起，轉基因技術為培育抗花葉病甘蔗育種提供了一條便捷、高效的途徑。同時，也在一定程度上提高了甘蔗的產量和糖分，推動了我國糖料事業的發展。但是，抗花葉病轉基因甘蔗與其他轉基因植物一樣，可能會帶來一定的生態風險。目前，我國雖然對抗花葉病轉基因甘蔗生態安全有一定的研究，但還存在著許多不足。一些問題還具有一定爭議，一些試驗設計，數據處理方法仍存在缺陷，不能確切地評估抗花葉病轉基因甘蔗的生態風險。在食品安全性的問題方面，只是根據國外的研究進行推測，目前還沒有確切的研究結論。而在土壤生態安全方面，由于土壤的復雜性，目前得出的結論仍然不具有很強的說服力。在對基因漂移和對病毒異源包裝和重組的研究，還屬于空白。這些問題說明目前在對抗花葉病轉基因甘蔗的研究還存在許多問題。

由于生態風險是一個主要而又復雜的問題，目前對于抗花葉病轉基因甘蔗以及轉基因植物而言，還沒有一個完善的安全評價體系。筆者希望從以下幾個方面進一步改良目前的評價體系：（1）由于甘蔗是一年生作物，對抗花葉病轉基因甘蔗生態風險評價需要長年定點定植，收集多年的數據，觀察多年生態變化，才能得出確切的結果；（2）使用合理的試驗設計，減少其他制約試驗的因素，尤其是對土壤生態環境研究方面。因為影響土壤因素太多，往往得出的結果不夠準確；（3）將數學建模的思想引入抗花葉病轉基因甘蔗生態安全的研究中。也許能夠更合理對其生態安全進行評價，而且該思想已經在其他方面環境評價中得到應用。

總之，對抗花葉病轉基因甘蔗安全性評價應該從多層次、多角度進行研究，然后建立科學的生物安全評價指標體系。

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