胰腺癌干細胞研究進展

杜志勇 韓寶三 彭承宏

·綜述與講座·

胰腺癌干細胞研究進展

杜志勇 韓寶三 彭承宏

胰腺癌是一種惡性程度極高，預后極差的腫瘤，手術切除率低且術后容易復發和轉移，并且對放、化療不敏感。目前，人們在腫瘤的研究中提出了腫瘤干細胞理論。該理論認為，腫瘤內部存在一小部分具有干細胞特性的細胞，即腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)，它具備無限增殖、多向分化、自我更新和極強的成瘤能力，形成腫瘤并維持腫瘤的生長，且對常規的放化療更不敏感，還可能是腫瘤轉移、復發的根源。該理論首先在血液系統腫瘤的研究中獲得突破[1]。在實體瘤中，目前已經在包括胰腺癌在內的多種腫瘤中分離出了相應的CSCs[2-3]。本文就胰腺癌干細胞(PCSCs)的相關研究進展綜述如下。

一、PCSCs的表型

2007年，兩個不同的研究小組分別報道了不同表型的PCSCs。Li等[4]將新鮮人胰腺癌標本種植于非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠皮下進行胰腺癌實質細胞的純化和擴增，再采用熒光激活細胞分選技術發現胰腺癌中存在0.2%～0.8%的CD44+CD24+ESA+細胞，該亞群細胞在NOD/SCID小鼠體內表現出高成瘤性，連續傳代成瘤實驗發現其致瘤能力及在胰腺癌細胞中的比例保持不變，組織學發現其形成的腫瘤和原發腫瘤類似，兩者的胰腺癌分化標志物SLOOP和stratifin也有相同的表達模式。這說明該亞群細胞具有極強的自我更新和分化能力，而且其高表達與干細胞自我更新密切相關的Shh和多梳基因家族Bmi-1，因此該亞群細胞被認為是PCSCs。Hermann等[5]從人胰腺癌組織和人胰腺癌細胞系L3.6pl中分選出CD133+細胞，發現其具備高成瘤、自我更新和多向分化特性。流式分析術發現CD133+細胞約占人胰腺癌組織中癌細胞總數的1%～3%，在大多數人胰腺癌細胞系中其含量低于1%，并發現CD133+細胞與CD44+CD24+ESA+細胞之間存在14%的重疊。他們認為，CD133+細胞可能是另一種表型的PCSCs。這一結果驗證了Olempska等[6]的推論，他們檢測了5株人胰腺癌細胞株CSCs標志物的表達，分析認為CD133和(或)ABCG2陽性可能代表PCSCs。最近，Rasheed等[7]報道，ALDH+胰腺癌細胞可能是另一種表型的PCSCs。這種表型的胰腺癌細胞在體外克隆形成能力和體內成瘤能力是未分選胰腺癌細胞和ALDH-細胞的5～11倍，其與CD44+CD24+細胞之間僅存在極少量的重疊。進一步研究發現，ALDH+CD44+CD24+細胞較ALDH+和CD44+CD24+細胞致瘤能力更強，但差別無統計學意義。遺憾的是他們沒有研究ALDH+與CD133+細胞之間的關系。上述研究結果提示，根據目前CSCs的鑒別手段和判定標準，胰腺癌中可能存在不同表型的CSCs。

二、PCSCs與胰腺癌轉移

2005年Saur等[8]報道，趨化因子受體4(CXCR4)的表達可顯著增加胰腺癌肝、肺轉移，AMD3100可阻止其轉移潛能。Hermann等[5]發現，雖然CD133+CXCR4-和CD133+CXCR4+胰腺癌細胞都能在無胸腺小鼠體內形成原發病灶，但只有CD133+CXCR4+細胞能形成轉移灶，去除這部分細胞，胰腺癌的轉移特性被廢除，給予CXCR4抑制劑AMD3100其轉移能力也大大降低。他們還發現，CD133+CXCR4+亞群所占比例越大，胰腺癌越容易發生轉移。因此，這部分細胞被認為是遷移性胰腺癌干細胞(mPCSCs)。最新研究表明[7]，ALDH+表型PCSCs可能富含mPCSCs。ALDH+和CD44+CD24+細胞之間的成瘤能力差異不大，但在遷移能力方面則表現出不同的生物學特性。ALDH+細胞在體外的遷移和侵襲能力是未分選胰腺癌細胞的3倍，CD44+CD24+細胞僅表現出輕微增加。ALDH+CD44+CD24+胰腺癌細胞更具侵襲性。臨床研究也證實[7]，胰腺癌轉移灶中ALDH表達率更高，原發灶ALDH表達陽性者更容易發生淋巴結和遠處臟器如肝、肺的轉移。抑制Shh Hegerhog信號途徑可以清除ALDH+PCSCs，從而使胰腺癌在體內的侵襲和轉移能力下降[9]。目前尚需進一步研究ALDH+與CD133+CXCR4+細胞之間的關系。

三、PCSCs與治療抵抗

CSCs通常具備以下特征[3,10-11]：多處于G0期；具有抗凋亡活性；具備強大的DNA修復能力；高表達耐藥蛋白；某些信號途徑如Wnt/β-catenin、Notch等的激活等。因此，CSCs更加耐受常規治療，PCSCs也不例外。研究表明[5-6,12]，不論是CD133+還是CD44+CD24+ESA+表型的PCSCs，都能耐受放、化療。胰腺癌細胞系在體外接受健擇干預后，CD133+和CD44+細胞含量顯著增加[5,13]。放射治療和健擇化療都能顯著富集荷瘤鼠CD133+、CD44+CD24+ESA+和ALDH+細胞[5,12]。我們的研究也顯示[14]，放化療抵抗的胰腺癌細胞系干細胞標志物Oct-4、ABCG2表達增加，體外克隆形成能力增強，在無胸腺小鼠皮下成瘤能力也更強；放化療抵抗的胰腺癌細胞系SW1990中CD24表達增加，說明治療抵抗的胰腺癌細胞中富含PCSCs。深入研究PCSCs耐受放化療的機制將有助于發掘出針對PCSCs的治療手段。

四、PCSCs與上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)

所謂EMT，是指上皮表型細胞在特定生理和病理情況下向間充質表型細胞轉化的現象，幾個與胚胎發育相關的轉錄因子Snail、Slug和Twist等通過抑制E-cad的轉錄在EMT的誘導中發揮關鍵作用[15-16]。

EMT與胰腺癌的侵襲轉移密切相關[17]。最近研究表明[7]，ALDH的表達與人胰腺癌淋巴結、肝和肺的轉移密切相關，而ALDH+胰腺癌細胞同時具備干細胞特征和間質表型特征。與未分選細胞比，CDH1(其編碼產物即E-cad)基因在ALDH+細胞中表達下降一半，在ALDH+CD44+CD24+細胞中下降90%；Slug在ALDH+細胞中表達增加51倍,而在ALDH+CD44+CD24+細胞中增加73倍。在EMT的誘導中起重要作用的轉錄因子ZEB1對CSCs“干性”的維持起重要作用。研究表明[18]，ZEB1敲除后可導致胰腺癌細胞球囊形成能力和成瘤能力下降，侵襲和轉移能力也下降，還導致胰腺癌細胞對化療藥物更敏感，干細胞因子Sox2、Bmi1和p63表達下調，穩定敲除后CD24mRNA表達下調。ZEB1可能通過對微小RNA(miRNAs)的調控來實現對CSCs“干性”的維持。某些miRNAs也參與CSCs“干性”的調控，下調其中起抑制“干性”作用的miRNAs的表達即可以維持干細胞表型。miR-200家族成員(miR-141,miR-200a、b、c和miR-429)的靶基因包括維持胚胎干細胞表型的分子，如Sox2、KLF4和Bmi1，因此，其可誘導細胞分化。它們還可以通過抑制ZEB1/2mRNA的轉錄來抑制EMT的發生，而ZEB1也可以抑制miR-200家族成員的表達，它們之間相互作用形成一個負反饋環。因此，ZEB1可通過抑制miR-200家族成員的表達而在維持“干性”中發揮重要作用。此外，ZEB1還可以通過抑制另一個重要的“干性”抑制因子miR-203的表達來維持胰腺癌和結腸癌細胞的腫瘤起始能力，并促進mPCSC的生成。

EMT還與胰腺癌治療抵抗有關。Wellner、Shah、Wang等[19-21]發現健擇耐受的多株胰腺癌細胞系發生了EMT。我們的研究也發現[22]，放化療抵抗的胰腺癌細胞系富含干細胞樣癌細胞，同時其也發生了EMT。有研究表明，健擇耐受的胰腺癌細胞系發生EMT與Notch通路的激活有關[20]，而Notch通路是重要的干細胞信號通路之一。治療抵抗誘導的EMT與PCSCs之間可能存在密切而復雜的關系。一方面，某些表型的PCSCs本身即可能表現為間質表型,并且PCSCs可能具備更強的EMT和MET相互轉化的可塑性。如Kabashima等[23]發現，胰腺癌細胞系來源的側群(SP)細胞具備更強的EMT和MET相互轉化的可塑性。SP細胞被認為是具有干細胞特性的一類細胞。另一方面，在治療選擇壓力下，CSCs自我更新受到抑制，放化療富集PCSCs可能不僅僅是簡單的通過殺死敏感的癌細胞來實現，治療抵抗誘導的EMT可能促進了PCSCs和mPCSCs的產生,分化相對成熟的癌細胞和PCSCs可能通過EMT和MET過程達到動態平衡。兩個獨立的研究小組在乳腺癌的研究中發現[24-25]，乳腺癌細胞在經歷EMT后獲得了與干細胞類似的特征，他們認為誘導EMT促進了乳腺癌干細胞的產生。Vesuna等[26]的最新研究表明，與EMT密切相關的轉錄因子Twist可以下調CD24的表達而促使乳腺癌干細胞的生成。在胰腺癌中，治療抵抗誘導的EMT是否促進了PCSCs和mPCSCs的生成還有待于深入研究。

五、針對PCSCs的治療策略

在充分了解CSCs自我更新機制的基礎上，選擇性阻斷其信號通路的關鍵靶點可以促使CSCs分化或誘導其凋亡，這種CSCs特異性的分化和消除治療有望從源頭上控制腫瘤的復發和轉移，從而獲得顯著的療效。此外，CSCs特異性表面標志也是潛在的治療靶標。

1．針對PCSCs自我更新途徑的治療：Li等[4]發現CD44+CD24+ESA+PCSCs中存在Shh途徑的激活，與正常胰腺上皮細胞相比，該表型PCSCs中Shh mRNA表達增加了46倍，而未分選的腫瘤細胞僅增加4倍。因此，針對Shh途徑的治療有可能對胰腺癌的治療有益。轉錄因子神經膠質細胞瘤相關抗原-1(glioma-associated antigen-1,Gli-1)介導了Shh途徑的激活，針對Gli1 mRNA的3′非編碼區(3′-untranslated region,3′-UTR)可有效抑制胰腺癌細胞增殖和誘導其凋亡[27]。Feldmann等[9]發現，裸鼠移植瘤經過健擇治療后，ALDH表達明顯增高，聯合應用Shh抑制劑環杷明(cyclopamine)后，ALDH減少三分之二。這表明Shh途徑被抑制后，PCSCs自我更新受抑制。但單獨環杷明治療并不能完全廢除其致瘤性，說明PCSCs中還存在其他信號途徑的激活并參與其自我更新。

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號途徑對維持CSCs的自我更新是必需的。p70s6激酶是mTOR下游的靶基因，其激活被認為是該通路激活的可靠標志[28]，p70s6激酶活化后可磷酸化其下游的核糖體S6蛋白(s6 ribosomal protein,s6rp)。Mueller等[29]分析胰腺癌組織中s6rp的磷酸化狀態，發現包括CD133+PCSCs在內的少部分胰腺癌細胞中mTOR途徑激活。于是他們應用Shh途徑抑制劑(環杷明/CUR199691)和mTOR阻斷劑雷帕霉素及健擇治療胰腺癌。結果顯示三聯治療可在體內外清除CD133+和CD24+CD44+ESA+細胞，還可以清除SP細胞，并且荷瘤鼠可以耐受三藥聯用，其生存期顯著延長。而單獨應用環杷明或雷帕霉素或加健擇雖然都可以導致CD133下降，但都不足以清除PCSCs。此外，他們還發現三聯治療還可以針對mPCSCs。單獨給予健擇或雷帕霉素或二者聯用都不能顯著減少胰腺癌細胞的遷移性，單獨使用環杷明雖然可以顯著降低其遷移能力，但必須和健擇聯用才能完全廢除其遷移性。流式分析術發現，給予健擇后同樣導致CD133+CXCR4+mPCSCs富集，而只有環杷明和健擇聯用或三聯治療才能完全清除CD133+CXCR4+亞群。體內實驗表明，健擇預處理過的胰腺癌細胞在免疫缺陷小鼠體內表現出明顯的轉移，而環杷明預處理的細胞轉移減少。健擇和環杷明二聯預處理進一步減少，三聯處理后不能成瘤及發生轉移。

2．針對某些miRNAs的治療：受p53調控的miR-34，其靶蛋白是Notch通路蛋白和Bcl-2，它在CSCs的維持和生存中也可能起作用。Ji等[30]發現，p53突變的人胰腺癌細胞系MiaPaCa2來源的CD44+/CD133+細胞高表達Notch/Bcl-2，而miR-34表達缺失。重建miR-34的表達不僅可以下調胰腺癌細胞中Bcl-2和Notch1/2的表達，還誘導其凋亡和細胞周期阻滯，增強化、放療敏感性，并顯著抑制腫瘤的克隆形成和侵襲，其致瘤性也顯著下降，流式分析術檢測發現CD44+/CD133+細胞減少87%。該結果顯示miR-34可能通過下調Bcl-2和Notch而在PCSCs的自我更新和(或)細胞命運決定中起重要作用。因此，對于缺乏p53-miR34的胰腺癌重建miR-34的表達可能具有重要意義。另外，針對ZEB1-miR-200反饋環的治療對胰腺癌而言可能是有效的治療途徑[19]。

3．針對PCSCs表面標志物的的靶向性治療：Salnikov等[31]應用針對PCSCs標志物——上皮黏附分子(EpCAM)的雙特異性抗體EpCAMxCD3 能明顯地延緩胰腺癌細胞株BxPC3移植瘤在SCID鼠上的生長。提示針對PCSCs表面標志物的靶向性治療也是值得進一步研究的內容。

4．針對EMT-PCSCs的治療：由于PCSCs本身即可能表現為間質表型，且分化相對成熟的癌細胞和PCSCs可能通過EMT和MET過程相互轉化，因此發現與CSCs和EMT相關的分子信息有助于開發新的針對CSCs和EMT的藥物，逆轉其間質表型將有助于增強其對傳統治療的敏感性[32-33]。

此外，胰腺癌富含基質成分，且處于低氧狀態，間質成分和低氧微環境都參與了胰腺癌的放化療耐受。并且低氧可以富集CSCs，并促進CSCs“干性”的維持和阻止其分化。因此，腫瘤微環境尤其是低氧微環境對PCSCs及治療的影響也值得進一步深入研究。

六、PCSCs標志物對胰腺癌復發和預后的判斷

Maeda等[34]發現，CD133的表達與人胰腺癌淋巴結轉移及預后差有關。Welsch等[35]認為，CD133和CXCR4的表達與腫瘤復發無關。Rasheed等[7]研究發現，胰腺癌原發病灶ALDH的表達與腫瘤大于3 cm、腫瘤分化程度低及淋巴結轉移相關，因此，原發灶ALDH表達陽性的患者預后更差，與原發灶ALDH表達陰性的患者相比，其中位生存期下降22%(14個月對18個月)。Hong等[13]的結果表明，胰腺癌CD44陽性提示預后差，CD44陽性者中位生存期短于CD44陰性者(16.9個月對25.3個月)。不同表型PCSCs對腫瘤復發及預后的影響可能不同，不同的PCSCs標志物對預后及復發的判斷價值也可能存在差異，因此還需要做大量前瞻性研究。

總之，深入了解PCSCs生物學行為及相關的分子調控途徑，將促進對胰腺癌侵襲、轉移及耐受常規治療的研究，為胰腺癌的治療帶來新的策略。

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2010-05-05)

(本文編輯：屠振興)

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