單核細胞趨化蛋白1在重癥急性胰腺炎相關肺損傷中的作用

許永春 李兆申 龔燕芳 金晶

·論著·

單核細胞趨化蛋白1在重癥急性胰腺炎相關肺損傷中的作用

許永春 李兆申 龔燕芳 金晶

目的探討單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)在急性壞死性胰腺炎(ANP)早期并發急性肺損傷(ALI)發病機制中的作用。方法按數字表法將40只SD大鼠隨機分為對照組和ANP 3、6、12 h組，每組10只。采用15%左旋鹽酸精氨酸2.0 mg/g體重腹腔注射方法制作大鼠ANP模型，觀察胰腺及肺組織病理學改變，檢測肺濕/干重比，RT-PCR檢測肺組織MCP-1 mRNA的表達。結果腹腔注射左旋鹽酸精氨酸后大鼠胰腺發生出血、壞死，符合ANP病理改變。ANP組肺組織明顯水腫，3、6、12 h的病理評分分別為3.75±0.58、5.50±0.63、5.86±0.54；肺濕/干重比為4.85±0.38、4.97±0.47、5.03±0.46；肺組織MCP-1 mRNA表達量為0.36±0.08、0.56±0.15、0.72±0.21。均較對照組的0.12±0.05、4.32±0.33、0.21±0.05顯著升高(P<0.05或<0.01)，且MCP-1 mRNA表達與肺濕/干重比及肺組織損害程度均呈正相關(r=0.75,r=0.89,P<0.05)。結論ANP早期肺組織MCP-1 mRNA表達上調，并在ANP并發的ALI中發揮重要作用。

胰腺炎，急性壞死性； 單核細胞趨化蛋白1； 肺組織； 基因表達

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)易并發急性肺損傷(acute lung injury，ALT)，繼續發展甚至導致急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。 目前認為，炎細胞的激活、遷移、聚集以及激活炎細胞所釋放的細胞因子，如單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等參與了此過程[1]。本研究檢測急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠肺組織MCP-1的表達，探討其在ANP早期肺損傷中所起的作用。

材料與方法

一、材料

健康雄性SD大鼠，體重200～250 g，上海第二軍醫大學實驗動物中心提供；左旋鹽酸精氨酸(L-arginine)，分析純級 (上海華美生物工程公司提供)，滅菌生理鹽水配置成15%溶液(pH7.0)。寶生物工程(大連)有限公司的一步反應法RT-PCR試劑盒；MCP-1及內參照β-actin引物根據GenBank中基因序列自行設計，由上海生工生物工程公司合成。

二、方法

1．動物模型制作與分組：按數字表法將大鼠隨機分為對照組和ANP 3、6、12 h組，每組10只。采用腹腔注射15%左旋鹽酸精氨酸2.0 mg/g體重兩次、間隔1 h的方法制備ANP模型。對照組腹腔注射等體積無菌生理鹽水。按各時間點處死大鼠，股靜脈采血1 ml，離心取上清置-20℃冰箱保存。

2．血清生化指標的檢測：采用酶法(麥芽6糖)檢測血淀粉酶，葡萄糖氧化酶法檢測血糖，化學比色法檢測血鈣，酶法檢測肌酐，速率法檢測谷丙轉氨酶，在HITACHI 7600型全自動生化分析儀(日本)上按標準規程操作。

3．肺濕/干重比測定：取肺組織置于60℃干燥箱內烤48 h至恒重，計算肺組織濕/干重比。

4．胰腺及肺組織病理學評價：取胰腺和部分左肺組織常規甲醛固定，脫水，石蠟包埋，HE染色，由專業病理醫師閱片。肺組織切片每張隨機選10個高倍鏡視野。肺組織損傷評分標準[2]見表1。

5．肺組織MCP-1 mRNA表達檢測：按Trizol液說明抽提新鮮肺組織總RNA。MCP-1引物(擴增片段290 bp)序列：上游5′-TTCACTGGCAAGATGATCCC-3′，下游5′-TGCTTGAGGTGGTTGTGGAA-3′；β-actin引物(擴增片段600 bp)序列：上游5′-AGGGTG-TGATGGTGGGTATG-3′，下游5′-CATAGC-TCTTCTCCAGGGAG-3′。RT-PCR反應條件：50℃ 60 min，95℃ 5 min；94℃ 30 s、60℃(MCP-1)或55℃(β-actin)30 s、70℃ 30 s， 35個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像掃描儀掃描，以MCP-1 mRNA條帶/β-actin條帶的灰度值比表示MCP-1 mRNA相對表達量。

表1 肺組織學評分標準

三、統計學處理

結 果

一、血清生化指標的變化

與對照組相比，ANP各組血淀粉酶、谷丙轉氨酶、血糖及肌酐水平顯著升高(P<0.05或<0.01)，且隨時間延長呈上升趨勢，而血鈣水平逐漸降低(P<0.05或<0.01，表2)。

二、胰腺、肺組織病理改變及肺濕/干重比

對照組胰腺外觀正常；ANP組大鼠胰腺腫脹明顯，質地較硬，有大片黃色壞死灶，大網膜、腸系膜上見大量皂化斑，腹腔有中至大量血性腹水。顯微鏡下，對照組胰腺腺泡和導管未見異常；ANP各組胰腺組織見大片出血、凝固性壞死及脂肪壞死，壞死區見大量中性粒細胞和單核細胞浸潤，血管破裂出血。

對照組肺組織正常；ANP 3 h組大鼠肺組織輕度水腫，6 h組水腫明顯、少量血性胸水，12 h組高度水腫，肺表面散在出血點，血性胸水。顯微鏡下，對照組肺組織結構清晰，肺泡壁完整，間質無水腫滲出；ANP 3 h組間質增寬、充血水腫，見中性粒細胞浸潤， 6 h組間質充血水腫、炎細胞浸潤，偶見間質出血，12 h組間質及肺泡腔均有較多中性粒細胞，部分聚集成團，間質、肺泡腔出血。ANP各組肺組織病理評分顯著高于對照組(P<0.01，表2)。對照組肺濕/干重比為4.32±0.33，ANP 3、6、12 h的肺濕/干重比分別為4.85±0.38、4.97±0.47、5.03±0.46，較對照組顯著增加(P<0.05或<0.01)。

表2 各組血清淀粉酶、血糖、血鈣、肌酐、谷丙轉氨酶以及肺組織病理評分的變化

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01

三、肺組織MCP-1 mRNA表達的變化

對照組肺組織MCP-1 mRNA有輕度表達，表達量為0.21±0.05；ANP組肺組織MCP-1 mRNA表達明顯高于對照組(P<0.05或<0.01)，3、6、12 h的表達量分別為0.36±0.08、0.56±0.15、0.72±0.21(圖1)。肺組織MCP-1 mRNA的表達與肺組織濕/干重比以及肺組織病理變化相關，相關系數分別為0.75和0.89(P<0.05)。

圖1對照組(1)及ANP 3(2)、6(3)、12 h(4)組大鼠肺組織MCP-1 mRNA的表達

討 論

SAP早期事件發生在腺泡內，一系列炎癥介質的級聯反應促使炎癥介質大量釋放進入血循環，導致重癥患者發生全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，而肺往往是最易受累的靶器官。研究表明，中性粒細胞、單核-巨噬細胞系統激活所釋放的細胞因子，如腫瘤壞死因子、白介素家族成員和血小板活化因子等是SAP并發ALI的重要始動和促進因素[1]。

趨化因子是一族低分子量、具有化學趨化作用的細胞因子，在生理和一些病理情況下起著促進細胞遷移，誘導整合蛋白活化、細胞呼吸爆發和其他細胞因子轉錄，促使多種淋巴因子釋放等作用[3-4]。MCP-1可由體內單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞等多種細胞產生，受各種炎癥因素刺激后合成增加，與受體結合激活細胞內信號轉導通路，導致胞質內Ca2+釋放，蛋白激酶C活化，趨化激活單核巨噬細胞向炎癥部位聚集參與炎癥反應，在敗血癥和其他一些炎癥反應中起關鍵作用。離體胰腺腺泡細胞培養研究表明，胰腺腺泡細胞能持續合成MCP-1，大劑量雨蛙肽或CCK刺激后可導致MCP-1的合成顯著增加，支持腺泡細胞自身合成的趨化因子可能是急性胰腺炎(AP)早期的炎癥介質之一[4-5]。在AP早期階段， MCP-1即在腺泡細胞中產生，同時在血清中MCP-1顯著升高[6]，拮抗MCP-1活性能減輕實驗性AP嚴重程度[7-8]。在AP的局部并發癥和遠處臟器損害的發病機制中，MCP-1較其他成員如MIP-1α、MIP-1β等起著更為關鍵的作用。

本實驗結果顯示，在大鼠ANP早期即有ALI的發生，誘發ANP 3 h后即可見大鼠肺損傷，12 h更嚴重，肺濕/干重比顯著增加，肺組織MCP-1 mRNA表達明顯上調，且肺MCP-1 mRNA表達與肺組織病理損傷程度及濕/干重比均成正相關，推測MCP-1可能是ANP早期并發ALI重要的前炎癥介質。

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2010-12-30)

(本文編輯：呂芳萍)

Roleofmonocytechemotacticprotein-1geneinacutelunginjuryduringacutenecrotizingpancreatitis

XUYong-chun,LIZhao-shen,GONGYan-fang,JINJing.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email:zhaoshenli56@gmail.com

ObjectiveTo explore the potential role of monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) gene in the pathogenesis of acute lung injury (ALI) in early acute necrotizing pancreatitis (ANP).MethodsForty SD rats were randomly divided into control group, ANP 3, 6, 12 h group with 10 rats in each group according to a number table. ANP was induced by intraperitoneal injection of 15% L-arginine solution at a dose of 2.0 mg/g body weight. Pathological changes of pancreases and lungs were observed. Lung wet/dry weight ratio was measured. Intrapulmonary expression of MCP-1 mRNA was evaluated by RT-PCR.ResultsAfter intraperitoneal injection of 15% L-arginine solution, the rat′s pancreas presented with bleeding, necrosis comparable with pathological changes of ANP. Pulmonary tissue edema was obvious. At ANP 3, 6, 12 h group, the pathological scores of the lung were 3.75±0.58,5.50±0.63,5.86±0.54, the wet/dry weight ratios were 4.85±0.38,4.97±0.47,5.03±0.46, the MCP-1 mRNA expressions were 0.36±0.08,0.56±0.15,0.72±0.21, which were significantly higher than those in the control group (0.12±0.05,4.32±0.33,0.21±0.05,P<0.05 or <0.01). The MCP-1 mRNA expression in lungs was significantly correlated with the degree of lung damage and wet/dry weight ratio of lungs (r=0.75,r=0.89,P<0.05).ConclusionsMCP-1 mRNA expression was up-regulated in the early phase of ANP in the lungs, and it may play an important role in ALI during ANP.

Pancreatitis,acute necrotizing； Monocyte chemoattractant protein-1； Lung； Gene expression

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.02.015

全軍醫藥衛生科研基金資助(08MA064)

200433 上海，第二軍醫大學附屬長海醫院消化科(許永春，現在南昌解放軍第九四醫院消化內科)

李兆申，Email:zhaoshenli56@gmail.com