SOX10蛋白在先天性巨結(jié)腸腸壁中的表達(dá)

吳小紅

(江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院胃腸外科,江蘇宜興,214200)

先天性巨結(jié)腸病(HD)是小兒外科常見的消化道畸形,主要病理改變是在狹窄的腸管黏膜下和腸肌層神經(jīng)叢的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞完全消失,通常伴有黏膜肌層肥大以及黏膜下和固有肌層肌間神經(jīng)數(shù)目和體積增加,其病因目前尚無定論。最近,研究人員發(fā)現(xiàn)了SOX10基因突變及表達(dá)異常與先天性巨結(jié)腸的發(fā)生有一定的關(guān)系,并且有關(guān)出生后組織中SOX10的細(xì)胞分布及表達(dá)已有報道[1],國內(nèi)此類研究目前還較少。本文運用Western blot技術(shù)檢測SOX10蛋白在散發(fā)性HD腸壁中的表達(dá),進一步了解HD在分子基礎(chǔ)上的發(fā)病機制,為臨床提供參考。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

實驗組:收集本院2004年11月～2009年10月手術(shù)切除的經(jīng)病理診斷為HD的病變段結(jié)腸標(biāo)本16例,分別取狹窄段、移行段、擴張段全層腸壁組織,用無菌生理鹽水沖洗表面污垢后,立即送-80℃恒溫冰箱中保存。16例患兒中,男性10例,女性6例,年齡14天～14歲,中位年齡 6歲。新生兒2例;1個月至9歲13例;14歲1例。長段型3例;普通型5例;短段型8例。均為散發(fā)性,無家族史,無合并其他主要臟器的先天性畸形或綜合征。

對照組:隨機選取16例非巨結(jié)腸手術(shù)患兒,年齡6天～6歲,男8例,女8例。其中肛門直腸畸形5例(肛門閉鎖2例、直腸閉鎖3例),均行結(jié)腸造瘺術(shù),腸套疊行腸吻合術(shù)8例,關(guān)瘺術(shù)3例。取造瘺口處腸壁,并經(jīng)病檢確認(rèn)存在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

1.2 方法

采用Western blot法分析測定,根據(jù)Bradford法測定樣本胞膜蛋白濃度后,取一定量的胞膜蛋白溶液,用5×電泳加樣緩沖液將胞膜蛋白裂解液稀釋成 5 μ g/μ L 的溶液 100 μ L,95 ℃水浴5 min后,-80 ℃保存?zhèn)溆谩嶒灂r,取 10 μ L的胞膜蛋白裂解溶液(含等量蛋白50 μ g)電泳轉(zhuǎn)膜。10%牛血清封閉1 h后,加山羊抗人SOX10多克隆抗體一抗(美國Santa cruz公司,1:400),4℃孵育過夜。PBS沖洗膜3遍后,加驢抗山羊二抗(上海碧云天生物技術(shù)研究所,濃度為1:2000),室溫孵育1 h后,PBS沖洗膜3遍,DAB顯色試劑顯色。Image J分析軟件測定條帶的灰度值,用GAPDH條帶的灰度值作內(nèi)對照進行校正,分別計算出各樣本的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

SOX10蛋白在HD患兒痙攣段表達(dá)減少,在移行段、擴張段、對照組的表達(dá)無明顯變化(圖1)。

痙攣段分別與移行段、擴張段、對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);移行段、擴張段、對照組之間相互比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1和圖2。

圖1 SOX10蛋白和GAPDH在痙攣段(A組)、移行

表1 SOX10蛋白在痙攣段、移行段、擴張段和對照組結(jié)腸腸壁的表達(dá)

圖2 SOX10蛋白在痙攣段、移行段、擴張段和對照組結(jié)腸腸壁的表達(dá)

3 討 論

HD主要病變?yōu)槟c道末端一段腸壁的腸神經(jīng)叢神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失,累及腸段持續(xù)異常收縮,其上段結(jié)腸仍然保持蠕動功能,結(jié)果導(dǎo)致代償性擴張、肥厚,最終形成巨結(jié)腸,又稱無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥。診斷通常結(jié)合主要癥狀、結(jié)腸的放射學(xué)表現(xiàn)、直腸測壓以及直腸活組織檢測的組織學(xué)特征,典型的組織學(xué)特征包括神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失和粗大的神經(jīng)干[2]。目前研究已表明,HD是一種多基因控制的疾病,一些基因的缺失或突變可導(dǎo)致微環(huán)境變化,引起腸神經(jīng)母細(xì)胞(神經(jīng)嵴胚細(xì)胞)遷移的停頓從而導(dǎo)致HD。文獻報道先天性巨結(jié)腸的病因可能與原癌基因RET、血內(nèi)皮素B受體基因(EDNRB)及其配基血管內(nèi)皮素-3基因(EDN3)有關(guān)[3]。

SOX10基因是近來發(fā)現(xiàn)的一種與HD發(fā)病機制相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,位于染色體 22q13,1[3]。SOX10編碼一個轉(zhuǎn)錄因子,其在胚胎期的神經(jīng)嵴細(xì)胞內(nèi)有表達(dá),這一現(xiàn)象出現(xiàn)在不同的神經(jīng)嵴細(xì)胞(如腸神經(jīng)元)從外胚層分離出來之前,此后,SOX10在細(xì)胞遷移過程中被轉(zhuǎn)錄。SOX10基因含一段高遷移率族:DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域。研究證實了瓦登布格綜合征(WS4)患者中存在SOX10基因突變,提示SOX10基因?qū)τ谠缙谏窠?jīng)嵴細(xì)胞系向黑色素細(xì)胞和腸神經(jīng)節(jié)的分化起調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。Southard等[4]研究發(fā)現(xiàn),SOX10的未成熟終止突變可引起神經(jīng)嵴衍生物表達(dá)缺失,證明在發(fā)生突變的胚胎中同時存在SOX10和EDNRB的異常表達(dá)及由于細(xì)胞凋亡而引起的神經(jīng)嵴衍生物的缺失。提示SOX10對非常早期的多能神經(jīng)嵴源性祖細(xì)胞的存活和發(fā)育是必需的。SOX10蛋白與其他轉(zhuǎn)錄因子或配體蛋白形成復(fù)合體調(diào)控基因的表達(dá),如SOX10可調(diào)控RET基因的表達(dá)[5]。SOX10在神經(jīng)嵴細(xì)胞分化為腸神經(jīng)細(xì)胞、腸神經(jīng)節(jié)的過程中起到調(diào)節(jié)和信號旁路的作用,其突變可導(dǎo)致伴發(fā)Shah-Waardenburg綜合征型的HD。而Sham等[6]對不伴有其他癥狀的HD患者進行SOX10測定時,發(fā)現(xiàn)第5外顯子1876位置處核苷酸堿基A被G代替,而且發(fā)現(xiàn)2例患者309密碼處發(fā)生CAC-CAT沉默突變。

作者通過對SOX10蛋白在非HD患兒和非癥狀的HD患兒結(jié)腸中的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn),SOX10蛋白在正常對照組的每個樣本都有表達(dá),表明SOX10在胚胎發(fā)育之后的成熟腸神經(jīng)系統(tǒng)有一定的作用。

[1] Pingault V,Bondurand N,Kuhlbrodt K,et al.SOX10 mutations in Patients with Waardenburg-HirschsPrung disease[J].Nat Genet,1998,18(2):171.

[2] Barshack I,Fridman E,Goldberg I,et al.T he loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung′s disease[J].J Clin Pathol,2004,57(7):712.

[3] Shimotake T,Tomiyama H,Aoi S,et al.Discrepancy between macroscopic and microscopic transitional zones in Hirschsprung′s disease with reference to the type of RET/GDNF/SOX10 gene mutation[J].J Pedi Surg,2003,38(5):698.

[4] Southard-Smith E M,Kos L,Pavan W J.Sox10 mutation disrupts neual crest development in Dom Hirschsprung mouse model[J].Nat Genet,1998,18(1):60.

[5] Lang D,Chen F,Milewski R,et al.Pax3 is required for enteric ganglia formation and functions with Sox10 to modulate expression of c-ret[J].J Clin Invest,2000,106(8):963.

[6] Sham M H,Liu V C,Fu M,et al.SOX10 isabnormally expresed in aganglionic bowel of Hirschsprung's disease in fants[J].Gut,2001,49(2):220.